Medicina sperimentale e terapeutica

Introduzione

Un sistema di analisi di monitoraggio cellulare in tempo reale (RTCA) è stato precedentemente sviluppato per il monitoraggio continuo delle colture cellulari aderenti (1). Questo metodo privo di etichette e non invasivo si basa sulla misurazione dell’impedanza elettrica (indice cellulare, CI) tra regioni interdigitate sulla base delle piastre di coltura tissutale. La misurazione CI fornisceinformazioni quantitative sullo stato biologico delle cellule aderenti. In realtà, il significato di CI è il numero di cellule di sopravvivenzasulla superficie della piastra E. Questi dati includono il numero di cellule, la vitalità e la morfologia come profilo in tempo reale (2-4). RTCAsystem è noto al dispositivo di diagnosi precoce della reazione cellulare come fenotipo adinamico contro alcuni reagenti (5).

Nel nostro studio precedente, la citotossicità di imatinib nel carcinoma oralsquamocellulare (OSCC) è stata valutata utilizzando il WST-8(5– 3-(2- dosaggio di metossi-4-nitrofenil)-2 – (4 – nitrofenil) – 2H-tetrazolo-3-ium) come misura di fine punto (6), e successivamente con un sistema RTCA (7).Le misure degli endpoint da MTT (3 brom 2,5-diphenyltetrazolium bromide) e WST-8 sono comunemente utilizzate per valutare la citotossicità. Tuttavia, tali saggi sono limitati dalle variazioni degli effetti di diversi agenti antitumorali su diverse linee cellulari. Inoltre, i valori IC50 calcolati mediante test endpoint in vitro tendono ad essere più elevati delle concentrazioni effettive in vivo (8,9).

Nel nostro studio precedente, i valori IC50 misurati dal sistema RTCA erano inferiori a quelli misurati dal test WST-8, suggerendo che il sistema RTCA può valutare sensibilmente la citotossicità e l’influenza di imatinib sulla cellula. Tuttavia, non è chiaro se la valutazione dei valori ic50 di altri agenti antitumorali che utilizzano il sistema RT sarebbe utile perché vi sono differenze nelle reazioni citotossiche tra farmaci molecolari mirati come imatinib e agenti antitumorali nel tempo.

In questo studio, dobbiamo selezionare il tipo di linee cellulari per determinare la differenza del profilo di reazione cellulare rispetto ai reagenti antitumorali in tempo reale utilizzando il sistema RTCA.Linea cellulare SQUU-A non invasiva e linea cellulare SQUU-B invasiva che sono stati stabiliti da tumori locali ricorrenti del cancro della lingua in un singolo paziente, sono stati selezionati perché eravamo impegnati in metastasi di ricerca della linea cellulare SQUU-B utilizzando la linea cellulare SQUU-A e la linea SQUU-Bcell (10-12). La linea cellulare SAS è stata stabilita dacarcinoma umano a cellule squamose fortemente differenziato della lingua(13). La linea cellulare NA è stata stabilitacome una linea cellulare che produce fibronectina (14). Inoltre, è stato riferito che la citotossicità dei reagenti anticancro in OSCC è stata valutata nella linea cellulare SQUU-A e nella linea cellulare SQUU-B (15), nella linea cellulare SAS (16), nella linea cellulare NA (17) utilizzando vari metodi convenzionali.Ecco perché, abbiamo selezionato quattro queste linee cellulari con ciascuna caratteristica caratteristica nel presente studio, che sono state utilizzate anche nel test citotossico nello studio precedente.

In questo studio, ci siamo concentrati su un nuovo dispositivo RTCA sviluppato per la misurazione in tempo reale e abbiamo valutato i valori di ic50 come una scala per valutare la citotossicità dei nostri agenti antitumorali in quattro linee cellulari OSCC. Questo ci ha permesso di ottenere informazioni sulle variazioni osservate tra i diversi reagenti antitumorali e le linee cellulari in tempo reale.

Lo scopo del presente studio era quello di ottenere i profili ic50 immediatamente dopo l’aggiunta di agenti antitumorali utilizzando un sistema RTCA. Questo studio ha dimostrato il vantaggio di valutare la citotossicità degli agenti antitumorali utilizzando un sistema RTCA rispetto ad un test endpoint.

Materiali e metodi

Reagenti e materiali

Il 5-fluorouracile (5-FU) è stato diluito a 100 mm di indimetilsolfossido (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, Stati Uniti d’America).Doxifluridina e carboplatino sono stati diluiti a 100 e 50 mM,rispettivamente, in acqua distillata. Docetaxel è stato diluito a 10 mm di inetanolo. Tutti i reagenti antitumorali provenivano da Wako PureChemical Industries, Ltd., (Osaka, Giappone) e conservato a -20°C.

Coltura cellulare

Linee cellulari OSC umane SQUU-A, SQUU-B, SAS e NAwere derivate da campioni di lingua umana. SQUU – A e SQUU-B, sono stati forniti da Morifuji-Wilson M (Kumamoto University,Kumamoto, Giappone), sono stati stabiliti da lingua ricorrente localetumori tumorali (18). SAS (13,19,20) eraacquistato dalla Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Giappone). NA (14) è stato gentilmente fornito dal Dr. Jun-ichi Iwata (Kyushu University; Fukuoka, Giappone). Tutte le linee cellulari sono state mantenute nel mezzo dell’Aquila modificato di Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Giappone) contenente il 10% di siero di vitello fetale (Biowest, Nuaille, Francia) a 37°C in atmosfera umidificata con5% di CO2.

La misurazione della proliferazione cellulare OSCC mediante il test di citotossicità RTCA

IC è stata acquisita dal sistema iCELLigence (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, USA) come sistema RTCA. Allmonitoring è stato eseguito a 37°C con contenuto di CO2 regolato (5%). Le piastre E (piastre di coltura per il sistema iCELLigence)contenenti 200 µl di terreno di coltura per pozzetto sono state equilibrate a37°C e l’IC è stato impostato a zero in queste condizioni. Sono state aggiunte cellule(2×104 cellule/pozzetto se non diversamente specificato) nel mezzo di coltura 560 µl Gli agenti antitumorali sono stati aggiunti a 24 ore dopo la semina delle cellule. L’IC è stato monitorato in tempo reale per 96 ore dopo la semina cell. I valori IC50 sono stati calcolati dal software di analisi RTCAData versione 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

La concentrazione di otto punti di quattro agenti anticancerreagenti è stata impostata in base ai valori di Cmax nello studio precedente(21-25). Inoltre, sono stati fissati punti di tempo durante 72 h, comprese 24 h e 48 h, che erano un metodo generale per valutare la citotossicità nel test end-point.

Curve fitting of the IC50data

Per calcolare i valori IC50 abbiamo usato la seguente formula sigmoidal dose-response: Y=Low CI + (HighCI-Low CI) / {1+10 ^ (Log IC50-X)}, dove ‘Low CI ‘rappresenta i valori CI minimi,’ High CI ‘ rappresenta i valori di maximumcell index, Y è l’indice di cella e X è il log ofconcentration (M).

Misurazione della proliferazione cellulare OSCC dal test WST-8

Dopo la semina iniziale e la coltura delle cellule OSCC, il mezzo di coltura è stato rimosso e sostituito con mezzo contenente anticanceragent. Dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione, 20µl WST-8 dye (Cell Counting Kit-8; Dojindo Corporation,Tokyo, Giappone) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo 3 h, le piastre sono state lette a450 nm / 655 nm. Il tasso di sopravvivenza cellulare è stato calcolato utilizzando ilformula sotto (7). I valori ic50 sono stati calcolati mediante regressione di approssimazione lineare della sopravvivenza percentuale rispetto alla concentrazione del farmaco.

Tasso di sopravvivenza cellulare (%) =(a-c)/(b-c) ×100 (a=assorbanza ad ogni concentrazione del reagente antitumorale,b=assorbanza a 0 µM del reagente antitumorale e c=assorbanza del bianco).

Analisi statistica

Tutti i dati sono indicati come media ± deviazione standard(SD) di tre esperimenti indipendenti. Le correlazioni tra i valori IC50 ottenuti utilizzando il sistema RTCA e il saggio WST-8 sono state valutate per la significatività statistica dallo Spearmantest. I valori a due code di P < 0.05 sono stati considerati assegnativi.

Risultati

Effetto antitumorale agentconcentration su OSCC proliferazione delle cellule utilizzando il RTCA sistema

Abbiamo valutato la citotossicità di quattro anticancerreagents (5-FU, doxifluridine, carboplatino, e docetaxel) in fourOSCC linee cellulari di monitoraggio IC valori per 96 ore dopo thecells sono state seminate a 2×104 cellule/pozzetto in materia di E-piastre(Fig. 1–4). I valori di CI sono stati diminuiti in modo adose-dipendente in tutte e quattro le linee cellulari OSCC. Pertanto, ilriduzione nei valori di CI correlata con la diminuzione della cella number.As mostrato in Fig. 2, il valore di CI forinvasive SQUU – B linea cellulare era inferiore a quelli di altri OSCC cells.As mostrato in Fig. 3, CI profileobtained per la linea cellulare SAS ha mostrato aumento ritardato dopo 48 h. Asshown in Fig. 4, il ofproliferation di tasso ed il valore massimo di CI nella linea cellulare di NA erano più alti di unof altre linee cellulari.

Misurazione in tempo reale dei profili ic50 degli agenti antitumorali nelle cellule OSCC utilizzando il sistema RTCA

I profili IC50 dei quattro agenti anticancro nelle quattro linee cellulari OSCC sono stati determinati dal sistema RTCAsystem e calcolati dal software commerciale fornito con lo strumento (un sottoinsieme dei dati SQUU-B sono mostrati in Fig. 5). I valori di IC50 eranoplottato per 72 h dopo l’aggiunta di agenti antitumorali. I valori IC50 a 24, 48 e 72 h per tutte e quattro le linee di cella sono riassunti nelle tabelle I-IV. Come mostrato in Fig. 5, c’era un ritardo nel citotossereazioni di 5-FU (Fig. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Mentre, le curve di vitalità cellulare ofSQUU-B utilizzando il test WST-8 sono state mostrate anche in materiali supplementari(Fig. S5–S8). I valori di R2 a 72 h dopo l’aggiunta di reagenti antitumorali nel test WST-8 erano bassi in quattro reagenti antitumorali rispetto a uno di 24 h e 48 h. Questi risultati hanno mostrato che è auspicabile che il test del punto finale sia eseguito a 24 h o 48 h da utilizzare come protocollo generale. In questo studio, le curve di vitalità cellulare del saggio WST-8 sono state mostrate in materiali complementari perché non c’erano novità nel modo di calcolare i valori IC50 usando il saggio WST-8.

Correlazioni tra misurazioni in tempo reale dei valori IC50 utilizzando il sistema RTCA e misurazioni endpoint dei valori IC50 utilizzando il saggio WST-8 in celle OSCC

Come mostrato in Fig. 6, valori IC50 a 24, 48, e 72 h utilizzando due metodi wereplotted. L’asse orizzontale mostra in tempo reale i valori IC50 misurati con il sistema RTCA, mentre l’asse longitudinale mostra i valori IC50 misurati con il test WST-8. È stata osservata una correlazione positiva tra i due tipi di metodo di analisi per misurare l’IC50 per ciascun agente antitumorale.I risultati di 5-FU, doxifluridine, carboplatino, e docetaxcelwere y=8.19 x+346.02 (R2=0.94,rs=0.66, *P<0.05), y=1.00 x+172.70(R2=0.91, rs=0.82, **P<0.01),y=1,90 x+206.81 (R2=0.92,rs=0.96, **P<0.01), andy=13.53 x+0.08 (R2=0.95,rs=0.73, *P<0.05), rispettivamente. I valori real-Time ic50 tendevano ad essere inferiori ai valori correspondingendpoint IC50.

Discussione

I valori CI calcolati dall’RTCA rappresentano anche lo stato della cella (3). Asshown in fichi. 1-5, i valori SD dei valori CI erano troppo piccoli per vedere. Ad esempio, tutti i valori SD in Fig.1 erano sotto 0,05. La ragione dei bassi valori di CI di SQUU-B ha suggerito che la proteina di adesione E-caderina svolge un ruolo essenziale nelle metastasi, con livelli ridotti di E-caderina che promuovono la migrazione cellulare e l’invasione cellulare (26). La ragione per gli alti valori massimi di CI ofNA è stata suggerita che è stato riferito che fibronectinaccelerated la proliferazione e l’adesione delle cellule dovuto la linea cellulare di ofNA della caratteristica come linea cellulare di produzione della fibronectina (6). Pertanto, le reazioni cellulari di ciascuna linea cellularecontro quattro reagenti antitumorali erano variabili. Non siamo riusciti a trovare la relazione causale tra i valori IC50 e la caratteristica delle linee cellulari in questo studio. Tuttavia, è importante rilevare una reazione cellulare in tempo reale come profilo CI per valutare la citotossicità del reagente antitumorale quando si considera l’applicazione farmaceutica all’uomo.

Il profilo IC50 della linea cellulare SQUU-B è stato descritto in Fig. 5 come arepresentative profilo IC50 perché non c’erano differenze nel modello di profilo IC50 nella stessa linea cellulare in caso dello stesso reagente, anche se abbiamo calcolato i valori IC50 in tutta la linea cellulare utilizzando quattro reagenti antitumorali. Abbiamo scoperto che i profili ic50 variavano per ogni agente antitumorale e in ogni linea cellulare OSCC. Come mostrato in Fig.5,5-FU e docetaxel hanno richiesto più di 24 h (48 h nella figura) per iniziare ad esercitare un effetto citotossico sulle cellule OSCC, mentre i valori di IC50 erano recuperati da circa 24 h(48 h nella figura) dopo l’aggiunta di doxifluridina e carboplatino. Pertanto, abbiamo suggerito che le differenze dei profili real-timeIC50 fossero causate dal reagente antitumorale. Tali osservazioni non sarebbero state possibili senza una misurazione in tempo reale utilizzando l’RTCA. Il monitoraggio in tempo reale dei valori ic50 ha anche rivelato che questi valori sono cambiati notevolmente nel tempo. Esiste la possibilità di non rilevare cambiamenti utilizzando metodi convenzionali, perché solo un punto temporale dell’IC50 dopo il trattamento con l’agente antitumorale è valutato da un test endpoint.

Il sistema RTCA è diverso dai tradizionali test endpointays perché la misurazione dell’impedenza non è invasiva e può fornire dati quantitativi di alta qualità sulla citotossicità in modo continuativo. Come mostrato in Fig.6, ci sono state correlazioni positive significative betweenIC50 valori ottenuti con il sistema RTCA e WST-8 saggio, anche se ci sono state alcune differenze in valori assoluti di CI come i valori di CI bassi ottenuti per la linea cellulare SQUU-B. Questi risultati hanno suggerito che anche un IC basso ottenuto per alcune linee cellulari sarebbe in grado di valutare l’elevata sensibilità citotossica nel sistema RT. Mentre, i valori IC50 in tempo reale erano inferiori ai valori endpoint IC50 quando i valori IC50 in tempo reale ottenuti con il sistema RTCA sono stati confrontati con i valori endpoint IC50 ottenuti con il test WST-8.Questi risultati suggeriscono che il sistema RTCA può essere utilizzato per valutare in modo sensibile l’effetto degli agenti antitumorali sulla proliferazione cellulare e sull’adesione.

Nel sistema RTCA, la cella aderente funge da isolante sulla superficie dell’elettrodo e modifica il mezzo ionico della soluzione elettrodica, aumentando l’impedenza (27). Quindi, CI è funzione della cellulanumero e rapporto delle cellule a diversi intervalli di tempo. CI = 0 quandonon c’è adesione cellulare (5). I CIchanges descritti dal sistema di RTCA sono fenotipo dinamico riflesso ofcell. Questi monitoraggio dinamico dell’interazione cellulare-farmaco ci permette di ottenere una migliore comprensione degli effetti temporali invitro, soprattutto immediatamente dopo il trattamento con il farmaco(28). La caratteristica cinetica di thecells offre informazioni penetranti che non possono essere acquisite da aconventional singolo test end-point come WST-8 saggio. Mentre, i risultati del test WST-8 si riflette reazione metabolica di survivalcell (29). La tossicità facendo uso del saggio WST-8 potrebbe essere sottovalutata se la reazione metabolica delle cellule weremained sebbene la reazione dinamica delle cellule fosse accaduta. Abbiamo suggerito che queste differenze principali in due metodi sono state indotte enormi differenze di valore IC50 fino a 8 volte tra due metodi come mostrato in Fig. 6A. Il nostro studio precedente ha riferito che IC50 di imatinib in SQUU-Acell calcolate dal sistema RTCA e dal test WST-8 erano 4 µM e 60µM, rispettivamente (sensibilità di 15 volte) (6,7). Altri gruppi di ricerca hanno riferito che IC50 di cisplatino nelle cellule HK-2 calcolate dal sistema RTCA e dal test WST-8 erano rispettivamente 0,76 µM e 25µM (sensibilità di 33 volte) (30,31).Questi dati precedenti hanno supportato i nostri dati per mostrare la validità.

È importante ottenere misurazioni daimmediatamente dopo il trattamento con agenti antitumorali per valutare sia gli effetti collaterali degli agenti che i suoi effetti desiderati. Tuttavia, ci sono poche segnalazioni di metodi utili che correlano i dati invitro con i dati umani in vivo. Abbiamo ritenuto che la misurazione in tempo reale utilizzando il sistema RTCA avrebbe giovato alla valutazione degli effetti collaterali degli agenti antitumorali nelle cellule normali.

I valori Cmax precedentemente riportati di 5-FU,doxifluridina, carboplatino e docetaxel sono 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), e 2 µM (24,25), rispettivamente, quando usato per il trattamento endovenoso negli esseri umani. I nostri dati sono correlati con i dati umani perché i valori Cmax sono stati inclusi nella gamma delle dosi sperimentali utilizzate in questo studio.

I sistemi RTCA sono il nuovo dispositivo principale per valutare la citotossicità, che impiegano l’intensità di impedenza dell’adesione cellulare e non l’attività enzimatica in cellule bersaglio come il test MTT. I valori IC50 degli agenti antitumorali calcolati dal sistema RTCA sono stati significativamente correlati con i livelli ic50 calcolati dal test endpoint convenzionale. Inoltre, il sistema RTCA ha ottenuto le misurazioni automaticamente in tempo reale immediatamente dopo il trattamento con agenti antitumorali.

In realtà, il sistema RTCA non può valutare direttamente la citotossicità concreta come la morte cellulare o l’apoptosi e così via,perché l’indice cellulare è stato calcolato in base all’impedenza. Questo è il motivo per cui, il dosaggio combinato tra il sistema RTCA e la misurazione della morte cellulare potrebbe essere un metodo efficace in caso di valutazione della reazione cellulare concreta come la morte cellulare o l’apoptosi con precisione.Ad esempio, la colorazione dell’annexina V o l’espressione del test caspasi-3per il rilevamento dell’apoptosi, il saggio di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) per il rilevamento della morte cellulare potrebbe essere metodi efficaci(32,33). Inoltre, potrebbe essere utile valutare l’espressione della proteina infiammatoria nelle cellule normali per la rilevazione degli effetti collaterali quando il reagente anticancro è stato aggiunto alle cellule normali seminate sulla piastra elettronica. Il monitoraggio dinamico in tempo reale durante la coltura cellulare, compresi i reagenti antitumorali, può fornire elementi di valore per la diagnosi precoce dell’efficienza terapeutica e dell’effetto collaterale, che non possono essere valutati nei metodi convenzionali nel saggio finale. Quindi, il valore IC50 calcolato dal sistema RTCA potrebbe essere un parametro utile per lo screening dal punto di vista della misurazione in tempo reale in automatico, evitando problemi o contaminazioni colorimetriche. Inoltre, il sistema RTCA consente l’analisi dell’intero periodo dell’esperimento e non richiede l’etichettatura che può influire negativamente sugli esperimenti di coltura cellulare.

La novità di questo studio è che il sistema RTCA potrebbe rilevare un’elevata sensibilità alla citotossicità rispetto a un metodo convenzionale, il test WST-8. Inoltre, il sistema RTCA ha potuto valutare preziosamente il valore di 50 in tempo reale senza limitare il periodo sperimentale per almeno 72 ore dopo l’aggiunta di reagenti antitumorali.

In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che i sistemi RTCASYSTEM sono utili per valutare la citotossicità e potrebbero essere utilizzati per il futuro sviluppo di agenti chemioterapici utilizzando cellule tumorali e la valutazione dei loro effetti collaterali nelle cellule normali. Inoltre, un sistema RTCA può essere utilizzato per valutare i profili di reazione cellulare, come la terapia combinata e le interazioni anticorpo-cellula o farmaco-farmaco, dei reagenti antitumorali.

Materiale supplementare

Dati di supporto

Riconoscimenti

Non applicabile.

Finanziamento

Non è stato ricevuto alcun finanziamento.

Disponibilità di dati e materiali

I dataset utilizzati e / o analizzati durante il presente studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su reasonablerequest.

Contributi degli autori

MH e MN hanno ideato e progettato lo studio. MH andTN ha eseguito gli esperimenti e acquisito i dati. MH ha analizzato i dati, preparato le figure e redatto il manoscritto. MH, TKY e MN hanno interpretato i risultati. MH e TKY modificato e rivisto themanuscript. Tutti gli autori hanno letto e approvato il finalmanuscript.

Approvazione etica e consenso per partecipare

Non applicabile.

Consenso del paziente alla pubblicazione

Non applicabile.

Interessi concorrenti

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

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