L’ESPERIMENTO
Come presentato nella risoluzione di problemi prova sull’ultimo numero di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Istruzione , l’unità di trascrizione di codifica gli enzimi della biosintesi del triptofano è regolata dal trp1 repressore: il triptofano che agisce come un corepressore si lega e attiva il repressore, che a sua volta si lega alla regione dell’operatore e blocca il movimento della RNA polimerasi e, quindi, la trascrizione dei geni strutturali trp E, D, C, B e A che codifica per gli enzimi della sintesi del triptofano. Tuttavia, questa inibizione è “che perde”: c’è qualche trascrizione dell’operone anche in presenza di triptofano; questo sprecherebbe energia per produrre enzimi che non sono necessari. Un secondo meccanismo di regolazione, chiamato attenuazione, abbatte questa trascrizione residua sull’operone trp .
Una breve regione tra l’operatore e il primo gene strutturale (trp E), chiamato leader (Fig. 1), è responsabile per l’attenuazione. La sequenza leader è lunga bas 140 basepairs e codifica per la regione 5’‐end dell’mRNA trp che precede il codone di iniziazione del primo gene strutturale. La regione leader dell’mRNA trp ha una struttura unica (Fig. 2 bis). Contiene un breve open reading frame (ORF) che codifica per un oligopeptide chiamato peptide leader. Due sequenze palindromiche (regione 1/2 e regione 3/4) producono un accoppiamento di base auto‐complementare che porta alla formazione di strutture a forcina. Il secondo tornante (regione 3/4) è seguito da un tratto di Noi, creando una caratteristica strutturale di alcuni terminatori di trascrizione. La codifica ORF per il peptide leader si sovrappone alla regione 1 e contiene due codoni per il triptofano. Inoltre, le regioni 2 e 3 sono complementari non solo alle regioni 1 e 4, rispettivamente, ma anche tra loro. Questa struttura piuttosto complicata della sequenza leader pone le basi per un ingegnoso meccanismo di regolazione per la trascrizione dell’operone.
Fig. 1. La struttura dell’operone triptofano di E. coli.(P, promotore; O, operatore; L, leader; E, D, C, B e A, geni strutturali. La figura non è disegnata in scala: le regioni P, O e L sono molto più corte dei geni codificanti proteine.)
Fig. 2. Attenuazione nella regolazione dell’operone trp di E. coli. a) La struttura della regione 5’‐end dell’mRNA trp. (b) Rilassamento dell’attenuazione nel mezzo a basso triptofano. (c) Risoluzione anticipata (attenuazione) della trascrizione trp in mezzo ad alto triptofano (per i dettagli vedere il testo).
L’attenuazione si basa sulla trascrizione / traduzione accoppiata nei procarioti: i ribosomi si legano agli MRNA nascenti formando complessi cromosomici–polisomi; quindi, la sintesi proteica inizia a crescere catene di mRNA. Se il triptofano non è disponibile (Fig. 2b), le bancarelle ribosoma nel peptide leader codifica ORFs interrompendo tornante 1/2 e portando alla formazione di tornante 2/3. Questo tornante impedisce la generazione del tornante di terminazione 3/4 (chiamato attenuatore) e, quindi, l’RNA polimerasi è in grado di continuare l’allungamento e trascrive l’intero operone in una trascrizione a tutta lunghezza. Tuttavia, se il triptofano è presente, il ribosoma continua a muoversi e impedisce la formazione di entrambi i tornanti 1/2 e 2/3 (Fig. 2 quater). L’attenuatore tornante 3/4 può formare e termina la trascrizione. Il peptide leader e l’RNA leader corto vengono quindi rapidamente degradati e i geni strutturali non vengono trascritti. Rivedere il meccanismo e risolvere il seguente test.
In questo esperimento fittizio vengono utilizzati due mutanti operonici trp: in uno di essi i due codoni UGG che codificano per il triptofano sono stati convertiti in GGGs (codoni per la glicina; designato “trp codon mutant” durante il test); nell’altro, la regione 3 è stata cancellata (“region 3 mutant”).
Wild‐type E. le cellule di coli, “trp codon mutants” e “region 3 mutants” sono coltivate in un terreno ricco contenente tutti gli amminoacidi (incluso il triptofano) in concentrazioni ottimali. Cosa succede a loro?
Analisi dell’esperimento
- (a)
se l’istruzione è supportata dalle informazioni fornite;
- (b)
se l’istruzione è contraddetta dalle informazioni fornite;
- (c)
se l’istruzione non è né supportata né contraddetta dalle informazioni fornite.
- 1)
_____ Le cellule mutanti del codone Trp muoiono.
- 2)
_____ Le cellule di tipo selvaggio crescono più velocemente.
- 3)
_____ Le cellule mutanti della Regione 3 crescono più lentamente in tali condizioni.
- 4)
_____ I complessi cromosomici–polisomi si formano sull’operone trp in tutte e tre le cellule.
- 5)
_____ Il triptofano è sintetizzato in quantità significative solo nelle cellule mutanti della “regione 3”.
- 6)
_____ Utilizzando un frammento di DNA leader trp come sonda, l’analisi Northern blot dell’RNA cellulare in “trp codon mutants” identifica una banda forte corrispondente a un RNA a 140 nucleotidi.
- 7)
_____ Utilizzando la stessa sonda, grandi quantità di trascritti operonici trp a lunghezza intera vengono rilevati in campioni di RNA di cellule wild‐type.
Le stesse cellule sono ora coltivate in un mezzo contenente tutti gli amminoacidi tranne il triptofano. Come si comportano le cellule in tali condizioni?
Analisi dell’esperimento
- (a)
se l’affermazione è supportata da informazioni fornite;
- (b)
se l’affermazione è contraddetta dalle informazioni fornite;
- c)
se la dichiarazione non è supportata né contraddetta dalle informazioni fornite.
- 8)
_____ Le cellule mutanti del codone Trp muoiono.
- 9)
_____ Le cellule di tipo selvaggio crescono più velocemente.
- 10)
_____ Le cellule mutanti della Regione 3 crescono più lentamente in tali condizioni.
- 11)
_____ I complessi cromosomici–polisomi si formano sull’operone trp in tutte e tre le cellule.
- 12)
_____ Il triptofano è sintetizzato in quantità significative solo nelle cellule mutanti della “regione 3”.
- 13)
_____ Utilizzando un frammento di DNA leader trp come sonda, l’analisi Northern blot dell’RNA cellulare in “trp codon mutants” identifica una banda forte corrispondente a un RNA a 140 nucleotidi.
- 14)
_____ Utilizzando la stessa sonda, grandi quantità di trascritti operonici trp a lunghezza intera vengono rilevati in campioni di RNA di cellule wild‐type.