Frontiers in Neuroscience

Introduzione

Nel XIX secolo, ≈80 anni dopo la scoperta del lattato (La−) da parte di Scheele (Kompanje et al., 2007), Louis Pasteur ha notato che le cellule di lievito facoltative crescevano più in condizioni aerobiche che anaerobiche, tuttavia il consumo di zucchero era diminuito e la fermentazione in alcol era meno in condizioni aerobiche (Pasteur, 1861). In precedenza, Pasteur (1858)aveva riconosciuto che alcuni tipi di lievito fermentato zucchero a La-in condizioni anaerobiche, ma non aerobiche. Questo fenomeno (sia per l’alcol che per la fermentazione) è stato chiamato Effetto Pasteur (Barnett e Entian, 2005). Un fenomeno parallelo è stato scoperto nel muscolo scheletrico e negli animali interi. Per muscolo scheletrico Fletcher e Hopkins (1907) ha riferito che La− maturati in muscoli anaerobici rana a riposo. Durante la stimolazione, La concentrazione () aumentava rapidamente nel muscolo anfibio anaerobico, ma scompariva quando questi muscoli affaticati potevano recuperare in un ambiente ricco di ossigeno (O2). Successivamente, Meyerhof ha dimostrato in modo conclusivo che il glicogeno era il precursore di La− nei muscoli isolati, e la via glicolitica completa è stata chiarita dai primi anni 1940 (Meyerhof, 1942; Brooks e Gladden, 2003). Il dogma tradizionale è stato costruito su questo quadro e altre ricerche sull’ipossia: Il piruvato è il prodotto finale della glicolisi in condizioni aerobiche e La-è il prodotto finale quando O2 è insufficiente. Schurr (2006) ha discusso questo dogma dal punto di vista del metabolismo cerebrale.

È ampiamente accettato che i valori intracellulari di PO2 di ≈0,5 Torr o meno risultino nella fosforilazione ossidativa limitata a O2, una condizione chiamata disossia (Connett et al., 1990), con conseguente La− produzione e accumulo. Tuttavia, Stainsby e Welch (1966) hanno riportato l’efflusso di La da un muscolo contraente apparentemente ben ossigenato. Successivamente, Jöbsis e Stainsby (1968) hanno osservato La− produzione e rilascio da un muscolo scheletrico canino contraente mentre la coppia redox NAD+/NADH stava diventando più ossidata, un’indicazione di un adeguato apporto di O2. Utilizzando un approccio diverso, la criomicrospettroscopia della mioglobina, per determinare la PO2 nel muscolo di gracilis del cane che si contrae a tassi progressivamente più veloci, Connett et al. (1986) ha rilevato un aumento dell’efflusso di La senza evidenza di disossia; i valori più bassi di PO2 erano generalmente dell’ordine di 2 Torr. Il suo nome deriva da Rich (1998) ha usato la spettroscopia di risonanza magnetica protonica (MRS) per determinare la saturazione della mioglobina (e quindi PO2 intracellulare) negli esseri umani durante l’esercizio graduato. In esperimenti paralleli con lo stesso tipo di esercizio, l’efflusso di La è stato determinato tramite differenze di concentrazione artero− venosa e flusso sanguigno. Hanno trovato La-efflusso in presenza di livelli intracellulari di PO2 (~3 Torr) che non dovrebbero limitare la fosforilazione ossidativa. Véga et al. (1998) ha anche riferito che il tessuto nervoso isolato e stimolato rilascia lattato durante le condizioni aerobiche.

Questi risultati, insieme ad altre abbondanti prove circostanziali, indicano che la produzione netta di La e l’efflusso dalle cellule possono verificarsi in condizioni aerobiche (Gladden,2004a, b). Infatti, Brooks (2000) ha proposto che “il lattato è stato prodotto tutto il tempo in cellule e tessuti completamente ossigenati.”Schurr (2006) ha discusso questa proposizione in dettaglio, proponendo che” la glicolisi procede sempre al suo passo finale, la reazione LDH e la formazione di lattato” nel tessuto cerebrale ma molto probabilmente anche in molti altri tessuti. Successivamente, Schurr e Payne (2007) e Schurr e Gozal (2012) hanno fornito prove sperimentali di supporto per questo postulato nelle fette di cervello ippocampale. Qui, abbracciamo questo concetto, proponendo che anche in assenza di accumulo netto di La, e in presenza di abbondante O2, La− è il prodotto finale naturale della glicolisi. È importante sottolineare che utilizziamo principi biochimici di base per sottendere questo concetto e reintrodurre lo shuttle del lattato da citosol a mitocondri.

La LDH Reazione è Vicino all’Equilibrio di Reazione

La− è formata la seguente reazione è catalizzata dall’enzima lattato deidrogenasi (LDH):

La costante di equilibrio è fortemente a favore di La− (1.62 × 1011 M−1) (Lambeth e Kushmerick, 2002), e attività LDH è in alto rispetto al putativo di regolamentazione degli enzimi del pathway glicolitico nel muscolo scheletrico (Connett e Sahlin, 2011), fegato, rene, muscolo cardiaco, la milza e il grasso (Shonk e Boxer, 1964), il cervello (Iwangoff et al., 1980; Morland et al., 2007) e tumori mammari sia maligni che benigni (Larner e Rutherford, 1978; Balinsky et al., 1984). È importante sottolineare che l’attività LDH è anche elevata rispetto agli enzimi regolatori putativi dell’ossidazione del piruvato; vedi Spriet et al. (2000) per il muscolo scheletrico, Morland et al. (2007) per il cervello, e Marie e Shinjo (2011) per il cancro al cervello. Mentre le misure dei rapporti tra La− e piruvato tissutale sono scarse, alcuni valori di esempio sono ≈7: 1 per il fegato (Liaw et al., 1985), ≈10-13:1 per il muscolo scheletrico a riposo (Sahlin et al., 1976; Liaw et al., 1985), e valori fino a 159:1 nel muscolo scheletrico immediatamente dopo l’esercizio dinamico esaustivo (Sahlin et al., 1976). Valori di riferimento per il rapporto La− piruvato nel cervello, utilizzando sonde di microdialisi, media 23: 1 (Reinstrup et al., 2000; Sahuquillo et al., 2014). Tipicamente, il rapporto aumenta a seguito di lesioni cerebrali traumatiche, anche in assenza di ischemia o basso tessuto PO2 {≥25 (Sahuquillo et al., 2014); ≥40 (Vespa et al., 2005)}. Nonostante la standardizzazione delle tecniche, i valori di microdialisi non riflettono necessariamente le concentrazioni tissutali reali (Sahuquillo et al., 2014). Tuttavia, questi valori di microdialisi da La a piruvato per il cervello umano non sono molto lontani dai valori (≈13:1) ottenuti su omogenati cerebrali di ratto (Ponten et al., 1973). Nel complesso, l’alto relativo anche con un’adeguata fornitura di O2, rafforza il ruolo dell’attività di LDH nel determinare l’aspetto della La. L’elevata attività LDH e La costante di equilibrio pendente della reazione LDH sono elementi chiave nella proposizione che La− è il principale prodotto finale della glicolisi essenzialmente in tutte le condizioni metaboliche. In poche parole, ogni volta che la glicolisi è operativa, indipendentemente dalla tensione locale dell’ossigeno, La− si sta formando nella maggior parte dei tipi di tessuti. Tuttavia, la quantità di La prodotta e effettivamente accumulata (cioè aumentata ) può essere alterata da fattori come la tensione O2, il tasso metabolico, l’attività mitocondriale disponibile e altri fattori.

Destini del piruvato

I potenziali destini del piruvato sono elencati di seguito. Proponiamo che nessuno di questi processi si verifichi ad una velocità che corrisponda alla conversione iniziale del piruvato in La -, assicurando così che La-sia sempre il prodotto finale della glicolisi.

1. Efflusso dalla cellula principalmente tramite trasportatori monocarbossilati (MCT). Tuttavia, La-è sempre presente in una concentrazione più elevata rispetto al piruvato e lascerà le cellule ad un ritmo più veloce rispetto al piruvato.

2. Conversione in alanina tramite la reazione di alanina aminotransferasi vicino all’equilibrio che ha una costante di equilibrio di circa 1 (Tiidus et al., 2012), quindi la concentrazione di alanina dovrebbe approssimare la concentrazione di piruvato e la conversione del piruvato in alanina non dovrebbe sminuire la conversione del piruvato in La−.

3. Reazioni gluconeogeniche / gliconeogeniche. Nei tessuti gluconeogenici, il piruvato può essere convertito in ossaloacetato in una reazione catalizzata dalla piruvato carbossilasi (Pascoe e Gladden, 1996). Nella glyconeogenesi del muscolo scheletrico, il piruvato può essere convertito in malato con catalisi da enzima malico (Pascoe e Gladden, 1996) o più probabilmente a fosfoenolpiruvato tramite inversione della reazione piruvato chinasi (Donovan e Pagliassotti, 2000). Queste reazioni rappresentano “inversione” della glicolisi e iniziano con La -, il prodotto finale naturale della glicolisi. Nel cervello, il glicogeno è più abbondante negli astrociti e da scarso a trascurabile nei neuroni (Cataldo e Broadwell, 1986). Sebbene la piruvato carbossilasi sia espressa in cellule astrogliali coltivate, oligodendrociti, cellule microgliali ed ependimociti (Murin et al., 2009), non siamo a conoscenza di alcuna informazione sulla capacità di una qualsiasi di queste cellule di sintetizzare il glicogeno da La−.

4. Trasporto attraverso la membrana interna mitocondriale con successiva conversione in acetil-CoA attraverso la reazione di piruvato deidrogenasi (PDH) seguita dall’ingresso nel ciclo dell’acido tricarbossilico e dall’ossidazione. Il piruvato attraversa la membrana mitocondriale interna tramite diffusione semplice e diffusione facilitata; i trasportatori sono un MCT (Hashimoto et al., 2006) e il vettore di piruvato mitocondriale (Divakaruni e Murphy, 2012). Per l’ossidazione continua del piruvato, il NADH che fa la spola nella matrice mitocondriale dalle navette malato-aspartato e glicerolo fosfato è altrettanto importante del trasporto del piruvato.

La presenza costante di La− e il suo accumulo durante i periodi di stimolazione glicolitica è la prova che la reazione LDH predomina su questi destini alternativi di piruvato.

La figura 1 illustra un modello di metabolismo intracellulare che chiamiamo “Navetta del lattato da citosol a mitocondri”; la sua origine può essere ricondotta a una revisione del metabolismo La di Stainsby e Brooks (1990). A causa dell’elevata attività LDH e di una costante di equilibrio molto in direzione di La−, La− è sempre il risultato predominante della glicolisi. Tuttavia, la formazione di La – non è sinonimo di La-accumulo e aumento . I mitocondri costituiscono un lavandino per il piruvato e in condizioni di lenta attività glicolitica con ampio O2, l’ossidazione nella maggior parte delle cellule è sufficiente per abbinare strettamente la produzione di glicolisi; transmembrane La-flux varierà tra lento rilascio e lento assorbimento con rilascio essendo la condizione più tipica. In modo analogo alla creatina chinasi e alla navetta della fosfocreatina, LDH tiene piruvato e La− in equilibrio in tutto il citosol cellulare. In questo scenario, La− è la specie primaria che viaggia verso il vicinato del reticolo mitocondriale, molto probabilmente nello spazio intermembrana in cui LDH è attaccato al lato esterno della membrana mitocondriale interna (Hashimoto et al., 2006; Gladden, 2008). Qui, La-viene convertito in piruvato per l’ingresso nei mitocondri, dato il relativo “lavandino” per il piruvato. Contemporaneamente, il NADH viene rigenerato dall’inversione della reazione LDH e la sua coppia di elettroni viene trasportata attraverso la membrana mitocondriale interna dalle navette malato-aspartato e glicerolo fosfato. Una differenza importante dalla navetta fosfocreatina è che due componenti chiave, La-e piruvato, a differenza della fosfocreatina, possono attraversare la membrana plasmatica e lasciare la cellula.

Il paradigma da Citosol a mitocondri postula che La-si forma sempre durante la glicolisi, anche se La-non si accumula ed è stabile. Naturalmente, se O2 è così basso che la fosforilazione ossidativa è inibita, allora La− produzione supererà la velocità con cui il metabolismo ossidativo può utilizzare piruvato e NADH, causando e La− efflusso a salire. Inoltre, se l’attività glicolitica aumenta anche con ampi livelli di O2, come nel muscolo scheletrico che si contrae ad intensità moderata o forse negli astrociti attivati (Pellerin e Magistretti, 2011), la produzione di La non sarà eguagliata dall’ossidazione del piruvato e aumenterà come il trasporto di La− fuori dalla cellula. Allo stesso modo, se l’attività enzimatica glicolitica è migliorata e/o la funzione mitocondriale (attività enzimatica ossidativa) è ridotta in modo tale che la glicolisi è favorita rispetto all’ossidazione, ci sarà una continua discrepanza tra La− produzione e successiva piruvato e NADH ossidazione con conseguente elevata e La− efflusso. Quest’ultima situazione è osservata nelle cellule tumorali di “Warburg” (Semenza, 2008) e nei pazienti con BPCO durante l’esercizio fisico in vivo (Maltais et al., 1996).

Con l’allenamento di resistenza, il contenuto mitocondriale del muscolo scheletrico è aumentato (Holloszy e Coyle, 1984), e ora c’è un lavandino più grande per il piruvato. L’aumento dell’attività ossidativa mitocondriale richiede livelli più bassi di stimolatori (ADP) per un particolare tasso di fosforilazione ossidativa; questi stessi stimoli sono stimolatori allosterici di enzimi glicolitici chiave, quindi la glicolisi viene ridotta. Inoltre, se il trasporto di La− membrana è inibito, in particolare nelle cellule che hanno già una mancata corrispondenza in cui la glicolisi è favorita rispetto al metabolismo ossidativo, è probabile che il cellulare aumenti con effetti potenzialmente deleteri sulla cellula (Le Floch et al., 2011). Inoltre, una forte inibizione dell’attività LDH totale nelle cellule glicolitiche dovrebbe impedire l’equilibrio e quindi ridurre la produzione, l’accumulo e l’efflusso di La (Fantin et al., 2006). Tuttavia, l’effetto della modifica del pattern di isozima LDH indipendente dall’inibizione o dalla riduzione dell’attività LDH totale deve ancora essere completamente risolto (Downer et al., 2006).

Direzioni future: Influenza dell’isoforma LDH e applicazioni al metabolismo tumorale

Quale impatto ha l’isoforma LDH e in che modo questa conoscenza può essere applicata al trattamento di malattie con metabolismo alterato, come i tumori?

In primo luogo, LDH è un enzima tetramerico composto da due subunità proteiche che ammontano a circa 135 kDa (Cahn et al., 1962). Il tetramero può assemblare come cinque isozimi separati formando tutte le combinazioni della forma M (muscolare) (prodotto del gene Ldh-A) o della forma H (cuore) (prodotto del gene Ldh-B) producendo: M4 (=A4 = LDH5), M3H1 (=A3B1 = LDH4), M2H2 (=A2B2 = LDH3), M1H3 (=A1B3 = LDH2) e H4 (=B4 = LDH1). I risultati delle indagini in vitro indicano proprietà cinetiche diverse rispetto all’affinità del substrato e all’inibizione tra questi isoenzimi. Gli isozimi dominati da M hanno valori Km 3,5-7 volte superiori per piruvato e La-rispetto alle forme dominate da H. Inoltre, i tipi H4 sono inibiti dal piruvato a concentrazioni superiori a ~0,2 mm mentre i tipi M4 sono poco influenzati da concentrazioni di piruvato fino a 5 mm (Plagemann et al., 1960; Stambaugh e Post, 1966; Quistorff e Grunnet, 2011b). L’isozima H4 è inibito da oltre 20-40 mm mentre l’isozima M4 è meno inibito dall’alto (Stambaugh e Post, 1966). Questi punti sono stati offerti come prova di differenze funzionali nel metabolismo cellulare di vari tessuti con le forme cardiache che promuovono l’ossidazione mentre le forme muscolari facilitano la formazione di La – (Cahn et al., 1962). La distribuzione dell’isozima LDH riscontrata in natura corrisponde a queste caratteristiche determinate in vitro. Ad esempio, le fibre muscolari scheletriche a contrazione rapida, glicolitica, di tipo II hanno una percentuale maggiore di isozima LDH di tipo M mentre i muscoli scheletrici a contrazione lenta, ossidativi, di tipo I e il muscolo cardiaco hanno una percentuale maggiore dell’isozima LDH di tipo H (Van Hall, 2000). Congruentemente, l’allenamento con esercizi di resistenza diminuisce la proporzione dell’isozima LDH di tipo M nei muscoli allenati (Van Hall, 2000). Nel cervello, gli astrociti (che sono postulati per avere un metabolismo glicolitico più alto), hanno una percentuale maggiore dell’isozima LDH di tipo M, mentre i neuroni (che si afferma abbiano un metabolismo ossidativo più alto), hanno una percentuale maggiore dell’isozima LDH di tipo H (Schurr, 2006; Pellerin e Magistretti, 2011). Nei tumori, le cellule glicolitiche di tipo “Warburg” hanno una percentuale maggiore di isozima LDH di tipo M mentre le cellule tumorali più ossidative hanno una percentuale maggiore di isozima LDH di tipo H (Semenza, 2008). Quindi, l’evidenza circostanziale dei modelli di distribuzione degli isozimi LDH coincide con la funzione percepita degli isozimi LDH come determinata in vitro.

Le prove sopra citate hanno portato alla conclusione che il pattern di isozima LDH è un fattore causale nel metabolismo della La. Per chiarire ulteriormente il ruolo della ripartizione dell’isozima LDH come coordinatore del metabolismo La, Summermatter et al. (2013) ha intrapreso un’indagine per testare il ruolo del perossisoma proliferatore-attivato recettore-γ coactivator 1α (PGC-1α) come regolatore dell’espressione del sottotipo di isozima LDH. PGC-1α è noto per essere importante nel coordinamento del metabolismo energetico cellulare (Wu et al., 1999). In risposta a una varietà di stimoli, PGC-1α stimola la biogenesi mitocondriale, promuove la transizione del muscolo scheletrico a un fenotipo più ossidativo e contribuisce al metabolismo alterato dei carboidrati e dei lipidi (Liang e Ward, 2006).

Summermatter et al. (2013) ha studiato topi transgenici PGC-1α specifici per i muscoli e topi knockout PGC-1α specifici per i muscoli e ha trovato (1) sangue più basso negli animali transgenici e sangue più alto negli animali knockout in risposta all’esercizio di resistenza e (2) ridotta espressione di LDH di tipo M negli animali transgenici e ridotto LDH di tipo H negli animali knockout. Questi autori hanno concluso, come afferma il loro titolo, che ” il muscolo scheletrico PGC-1 α controlla l’omeostasi del corpo intero attraverso l’attivazione α-dipendente del recettore correlato agli estrogeni di LDH B e la repressione di LDH A.”A loro avviso, il modello di isozima LDH è un giocatore importante nel metabolismo di tutto il corpo di La−.

Tuttavia, ci sono ammonimenti poco apprezzati per quanto riguarda le funzioni dell’isozima LDH e i loro potenziali ruoli nel metabolismo. Innanzitutto, le proprietà cinetiche di cui sopra per le isoforme LDH sono state determinate in vitro a 20 o 25°C e i valori Km per il piruvato aumentano con la temperatura, approssimativamente raddoppiando a 37 ° C rispetto a 25 ° C (Latner et al., 1966; Quistorff e Grunnet, 2011b). In precedenza, Newsholme e Leech (1983), Van Hall (2000), Newsholme (2004), Allietare (2008), e Quistorff e Grunnet (2011a), hanno sollevato importanti questioni circa il ruolo di LDH isoenzimatici profili in La− produzione vs. utilizzo, rilevando che: (1) gli enzimi non modificare la costante di equilibrio di una reazione; (2) l’LDH reazione è vicino all’equilibrio, riducendo al minimo gli effetti; (3) le differenze nei livelli di LDH isoenzimatici funzione in vivo sono forse abbastanza modesta, a causa della maggiore temperature fisiologiche e vincolante per le strutture o altre proteine; (4) le concentrazioni di La− e piruvato necessarie per l’inibizione dell’LDH in vitro sono molto più alte delle più alte concentrazioni osservate in vivo; e (5) L’inibizione dell’LDH in vitro può essere dovuta a tracce della forma enolica del piruvato che hanno meno probabilità di essere presenti in vivo.

Anche se Summermatter et al. (2013) affermano con convinzione che il modello di isoforma LDH è un fattore importante nel metabolismo La di tutto il corpo, c’è un difetto fatale nel loro design. Hanno ignorato il fatto che i topi transgenici α PGC-1 hanno aumentato la proliferazione mitocondriale e gli enzimi di fosforilazione ossidativa, mentre i topi knockout PGC-1α hanno riduzioni significative delle attività della citocromo ossidasi e della citrato sintasi (Arany et al., 2005). A nostro avviso, questi cambiamenti nella funzione mitocondriale, l’elevata attività LDH totale precedentemente notata indipendentemente dal pattern isozimatico e la natura quasi di equilibrio di questa reazione rendono le conclusioni di Summermatter et al. (2013) insostenibile. Pertanto, concludiamo che gli esatti ruoli fisiologici e biochimici degli isoenzimi LDH in vivo rimangono da chiarire definitivamente.

Infine, per quanto riguarda il metabolismo tumorale, capire che La-è il prodotto finale della glicolisi è fondamentale per progettare interventi per il targeting dei tumori. In breve, esperimenti di Cori e Cori (1925) e di Warburg et al. (1927) ha mostrato che i tumori sembravano consumare avidamente glucosio e produrre La−. Il successivo dogma nel metabolismo tumorale ha affermato che i tumori presentano un “effetto Warburg”, producendo ed esportando La−. Tuttavia, ora sappiamo che non solo diversi tipi di tumore gestiscono La-in modo diverso (alcuni sono produttori netti; alcuni sono consumatori netti), ma anche all’interno di un singolo tumore ci possono essere spola tra diversi tipi di cellule; una cellula a cellula La− shuttle (Semenza, 2008). Molte cellule tumorali sono consumatori poveri di lattato (Sonveaux et al., 2008) scatenando la speculazione che l’ipoglicemia protetta a La–può essere terapeutica (Nijsten e van Dam, 2009). Al contrario, alcuni tumori utilizzano avidamente La-come combustibile e rispondono a La-supplementare con una maggiore proliferazione e vascolarizzazione, probabilmente un risultato diretto della sovraregolazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e del fattore 1α inducibile dall’ipossia (HIF-1α). In un recente studio su un modello animale di un sarcoma, Goodwin et al. (2014) ha riferito che La− ha guidato la sarcomagenesi in assenza di ipossia. Sorprendentemente, la nostra comprensione del metabolismo La nel cancro rimane instabile quasi 90 anni dopo i primi studi di Warburg.

Conclusioni

La nostra comprensione della La− formazione è cambiata drasticamente dalla sua scoperta. Tradizionalmente, il piruvato è stato pensato per essere il prodotto finale della glicolisi quando O2 è presente e La− il prodotto finale durante i periodi di disossia. Alla fine del ventesimo secolo e all’inizio del ventunesimo secolo è stato scoperto che l’O2 non si limita alla fosforilazione ossidativa nella maggior parte delle condizioni cellulari, e La− è effettivamente prodotta anche quando non vi è alcuna limitazione sul tasso di consegna di O2 ai mitocondri. Un’ulteriore riflessione sull’attività dell’enzima LDH e la costante di equilibrio della sua reazione fanno avanzare la proposizione che La− è il prodotto finale primario della glicolisi sotto la maggior parte, se non tutte le condizioni metaboliche nella maggior parte delle cellule. Il ruolo dei diversi isoenzimi LDH nel metabolismo non è così chiaramente evidente come la maggior parte dei ricercatori suggerisce, e concludiamo che la loro funzione esatta rimane sconosciuta. Se siamo corretti o meno sulla navetta del lattato da citosol a mitocondri come descritto qui e il ruolo incerto delle isoforme LDH sarà difficile da valutare in condizioni in vivo. Un approccio è la modellazione in silico. Comprendere i meccanismi esatti della glicolisi e del metabolismo La non solo approfondirà la nostra comprensione del metabolismo nei tessuti sani, ma fornirà anche informazioni sui tessuti malati o feriti, con le applicazioni più ovvie che sono il metabolismo dei carboidrati squilibrato presente nelle cellule tumorali (Vander Heiden et al., 2009) e metabolismo cerebrale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche (Brooks e Martin, 2014).

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.