Gasteyer ha sviluppato un’esperienza comica con il gruppo di improvvisazione – sketch comici di Los Angeles The Groundlings. Ha interpretato piccoli ruoli in Seinfeld (come cliente condannato di The Soup Nazi), così come negli spettacoli Party of Five, Frasier, Hope & Gloria e NYPD Blue. Nel 1996, Gasteyer si unì al cast di Saturday Night Live. Tra i suoi personaggi più popolari erano liceo insegnante di musica Bobbie Mohan-Culp, National Public Radio Delicious piatto ospite Margaret Jo McCullen, Lilith Fair cantante femminista Cinder Calhoun, e le sue impressioni di Martha Stewart e Celine Dion. Nel 2000, lei e Chris Parnell provino per succedere a Colin Quinn come co-anchors del news parodia segmento Weekend Update, ma le posizioni alla fine è andato a Tina Fey e Jimmy Fallon.
Dopo sei stagioni, Gasteyer lasciò la SNL nel 2002. Successivamente, è apparsa in vari programmi televisivi, film e produzioni teatrali. Nel 2004, Gasteyer ha interpretato la madre del personaggio principale Cady Heron (Lindsay Lohan) nel lungometraggio Mean Girls, scritto da SNL castmate Tina Fey. Il film ha anche caratterizzato altri ex membri del cast SNL, tra cui Fey, Tim Meadows, e Amy Poehler. È anche apparsa nel film musicale del 2005 Showtime Reefer Madness come Mae, la fidanzata condannata di Jack e proprietario del Reefer Den.
Gasteyer ha recitato in un revival dell’Opera da tre soldi a Broadway come Mrs. Peachum, insieme a Jim Dale, Alan Cumming e Cyndi Lauper. La produzione è durata dal 24 marzo al 25 giugno 2006.
Il 24 giugno 2005, Gasteyer ha dato origine al ruolo di Elphaba nella produzione sit-down di Chicago del musical Wicked, al fianco di Kate Reinders nel ruolo di Glinda. La produzione ha aperto il 13 luglio 2005. Gasteyer è stato nominato per un Jefferson Award per la sua performance. Ha suonato la sua ultima performance il 22 gennaio 2006, sostituita dalla sua standby Kristy Cates. In seguito ha ripreso il ruolo nella produzione di Broadway dal 10 ottobre 2006 al 7 gennaio 2007, sostituendo Eden Espinosa.
Il 12 aprile 2007, i media hanno annunciato che Gasteyer si era unito al cast dell’allora nuovo musical, Writing Arthur, per il New Works Festival 2007 per TheatreWorks in California, che si è svolto dal 14 aprile al 22 aprile. Gasteyer si è esibito a Chicago nel Stephen Sondheim musical Passion al Chicago Shakespeare Theatre dal 2 ottobre 2007 all ‘ 11 novembre 2007.
È stata originariamente lanciata come Gloria nei Bis! Produzione di serie estiva di Damn Yankees, ma a causa di un infortunio durante le prove, è stata sostituita da Megan Lawrence. Gasteyer ha preso parte alla lettura della versione musicale di Broadway del First Wives Club.
Ha recitato nel ruolo di Kitty Dean nella commedia di Broadway, La famiglia reale, che ha iniziato le rappresentazioni al Samuel J. Friedman Theatre il 15 settembre 2009 e ha aperto ufficialmente l ‘ 8 ottobre 2009. Lo spettacolo ha concluso la sua corsa il 13 dicembre 2009. Gasteyer ha anche interpretato il ruolo di Frisco Kate Fothergill nei City Centers Encores! produzione di Girl Crazy, in esecuzione dal 19 novembre al 22 novembre 2009.
È tornata al Saturday Night Live per un episodio speciale della festa della mamma l ‘8 maggio 2010 e per un altro episodio della festa della mamma l’ 11 maggio 2012.
Gasteyer è apparso nell’ottava stagione di Curb Your Enthusiasm come la fidanzata di Larry David.
Dal 2011 al 2014, Gasteyer ha interpretato Sheila Shay nella serie comica Suburgatory della ABC e, a partire da marzo 2013, è stata portavoce del programma di dieta Weight Watchers.
Nel 2014, approfittando della sua formazione come cantante, Gasteyer ha registrato e pubblicato I’m Hip, un album di standard jazz. “One Mint Julep” era una delle selezioni che includeva. Nel 2015, ha giocato Mimi Schwinn nel New York City Center Encores! Revival off-Broadway del musical A New Brain, che appare anche nella registrazione del cast.
Dal 2016 al 2017, Gasteyer ha avuto un ruolo da protagonista nel cult di TBS People of Earth, come leader di un gruppo di supporto ai rapiti alieni.
Nell’ottobre 2019, ha pubblicato l’album di vacanza Sugar & Booze. Gasteyer in seguito è apparso come concorrente nella seconda stagione di The Masked Singer sotto le spoglie di “The Tree”, finendo la competizione al sesto posto.
Nel febbraio 2020, Gasteyer interpreterà il ruolo di Katherine Hastings nella commedia pilota della NBC American Auto, scritta da Justin Spitzer. Nel settembre e ottobre 2020, ha doppiato un panda rosso di nome Nut in una serie animata per adulti intitolata Magical Girl Friendship Squad.