| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
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 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
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| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structures: | Pfam | PDB | PDBsum | |||
Taq PolA a une structure globale similaire à celle de E. coli PolA. Le domaine de l’exonucléase moyenne 3′-5′ responsable de la relecture a été radicalement modifié et n’est pas fonctionnel. Il possède un domaine d’exonucléase 5′-3′ fonctionnel au niveau du terminal amino, décrit ci-après. Les deux domaines restants agissent en coordination, via un mouvement de domaine couplé.
Domaine d’exonucléasedit
La Taq polymérase l’exonucléase est un domaine présent dans l’amino-terminal de l’ADN polymérase I de Taq (thermostable). Il suppose un motif de type ribonucléase H. Le domaine confère une activité exonucléase 5′-3′ à la polymérase.
Contrairement au même domaine chez E. coli, qui dégraderait les amorces et doit être éliminé par digestion pour une utilisation par PCR, ce domaine ne dégraderait pas l’amorce. Cette activité est utilisée dans la sonde TaqMan: au fur et à mesure de la formation des brins filles, les sondes complémentaires au gabarit viennent en contact avec la polymérase et sont clivées en morceaux fluorescents.
Liaison avec DNAEdit
La Taq polymérase est liée à sa fente du site actif de la polymérase avec l’extrémité émoussée de l’ADN duplex. Comme la polymérase Taq est en contact avec l’ADN lié, ses chaînes latérales forment des liaisons hydrogène avec les purines et les pyrimidines de l’ADN. La même région de la Taq polymérase qui s’est liée à l’ADN se lie également à l’exonucléase. Ces structures liées à la polymérase Taq ont des interactions différentes.
MutantsEdit
Une expérience de mutagenèse dirigée sur le site qui améliore l’activité de l’exonucléase 3′-5’vestigale d’un facteur 2 a été rapportée, mais il n’a jamais été indiqué si cela diminuait le taux d’erreur. Suivant une ligne de pensée similaire, les protéines chimères ont été fabriquées par des domaines de cueillette de cerises de la polymérase I d’E. coli, Taq et T. neapolitana. En échangeant le domaine vestigal contre un domaine fonctionnel d’E. coli, une protéine a une capacité de relecture mais une température optimale inférieure et une faible thermostabilité.
Des versions de la polymérase sans domaine exonucléase 5′-3′ ont été produites, parmi lesquelles Klentaq ou le fragment de Stoffel sont les plus connus. L’absence totale d’activité exonucléasique rend ces variantes adaptées aux amorces présentant une structure secondaire ainsi qu’à la copie de molécules circulaires. D’autres variantes incluent l’utilisation de Klentaq avec une polymérase haute fidélité, une thermoséquénase qui reconnaît les substrats comme le fait l’ADN polymérase T7, des mutants avec des tolérances plus élevées aux inhibiteurs, ou des versions « marquées par domaine » qui ont un motif hélice-épingle à cheveux-hélice supplémentaire autour du site catalytique pour maintenir l’ADN plus étroitement malgré des conditions défavorables.
Signification dans la détection de la maladiedit
En raison des améliorations apportées à la Taq polymérase dans la réplication de l’ADN par PCR: une spécificité plus élevée, moins de produits non spécifiques, et des processus et des équipements plus simples, il a joué un rôle déterminant dans les efforts déployés pour détecter les maladies. « L’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans le diagnostic des maladies infectieuses a permis de diagnostiquer rapidement et de traiter de manière appropriée les maladies dues à des agents pathogènes exigeants, de déterminer la sensibilité aux antimicrobiens des organismes à croissance lente et de déterminer le degré d’infection.”La mise en œuvre de la Taq polymérase a sauvé d’innombrables vies. Il a joué un rôle essentiel dans la détection de nombreuses maladies parmi les pires au monde, notamment la tuberculose, la pharyngite streptococcique, la pneumonie atypique, le sida, la rougeole, l’hépatite et les infections urogénitales ulcéreuses. La PCR, la méthode utilisée pour recréer des copies d’échantillons d’ADN spécifiques, permet la détection de la maladie en ciblant une séquence d’ADN spécifique d’un agent pathogène ciblé à partir de l’échantillon d’un patient et en amplifiant des traces des séquences indicatives en les copiant jusqu’à des milliards de fois. Bien qu’il s’agisse de la méthode de détection de la maladie la plus précise, en particulier pour le VIH, elle n’est pas effectuée aussi souvent que des tests alternatifs et inférieurs en raison du coût, de la main-d’œuvre et du temps nécessaires relativement élevés.
La dépendance à la Taq polymérase comme catalyseur du processus de réplication de la PCR a été mise en évidence lors de la pandémie de COVID-19 de 2020. Les pénuries de l’enzyme nécessaire ont empêché les pays du monde entier de produire des kits de test pour le virus. Sans Taq polymérase, le processus de détection de la maladie est beaucoup plus lent et fastidieux.
Malgré les avantages de l’utilisation de la Taq polymérase dans la détection des maladies par PCR, l’enzyme n’est pas sans défauts. Maladies rétrovirales: VIH, HTLV-1 et HTLV-II; incluent souvent des mutations de la guanine à l’adénine dans leur génome. Des mutations telles que celles-ci permettent aux tests PCR de détecter les maladies, mais le taux de fidélité relativement faible de la Taq polymérase fait que la même mutation G-A se produit et peut-être donne un résultat de test faussement positif.