1 Théorie
Les oligonucléotides sont synthétisés par l’ajout d’une base à la fois, s’étendant de l’extrémité 3′ à l’extrémité 5′, attachée à un support en phase solide. Lorsque la synthèse chimique de l’oligonucléotide est terminée, la chaîne d’ADN est libérée du support solide par incubation avec de l’hydroxyde d’ammonium. L’ammonium agit également comme un agent déprotecteur, coupant les groupes protégeant les phosphates dans les liaisons phosphodiester. Après cela, de l’ammoniac chaud est ajouté pour hydrolyser les groupes protecteurs des groupes aminés exocycliques de la désoxyadénosine, de la désoxycytosine et de la désoxyguanosine. L’oligonucléotide pourrait être fourni à l’utilisateur dans la solution d’ammoniac sous forme de préparation brute. Dans ce cas, avant utilisation, il peut être nécessaire de réaliser une étape supplémentaire pour éliminer les sels et sous-produits de la préparation oligonucléotidique générée lors de la déprotection.
Après déprotection, la préparation d’oligonucléotides est habituellement dessalée, quantifiée, évaporée à sec dans un lyophilisateur, et fournie à l’utilisateur sous forme de poudre. La solution d’oligonucléotide dessalée contient l’oligonucléotide intégral mais contient également un mélange de produits tronqués qui se sont accumulés lors de la synthèse chimique. La troncature se produit lorsque la base spécifiée ne s’ajoute pas à la chaîne dans le cycle correspondant (Hecker & Rill, 1998). Ainsi, le pourcentage de produits tronqués accumulés dans la préparation est déterminé par l’efficacité de synthèse (la fraction de produit intégral après synthèse) et la longueur de la molécule. Les oligonucléotides longs, qui nécessitent plus de cycles pour être synthétisés, sont moins purs que les oligonucléotides courts. Ces défaillances peuvent concurrencer le produit intégral dans certaines applications et peuvent nécessiter une élimination avant que l’oligonucléotide puisse être utilisé. Cependant, les préparations d’oligonucléotides dessalées conviennent généralement à de nombreuses applications, telles que la PCR standard ou les microréseaux, en particulier si l’oligonucléotide a une longueur < de 20 nucléotides.
Une purification supplémentaire pour les oligonucléotides de plus de 50 bases est recommandée car le pourcentage de produit intégral dans la préparation n’est généralement pas supérieur à 80%. Pour les applications exigeantes où la longueur exacte de l’oligonucléotide est importante, telles que les tests par décalage de gel, la mutagenèse dirigée par site, le séquençage, la production d’adaptateurs de clonage ou la synthèse d’ADNc de premier brin pour la génération de banques, une purification supplémentaire est recommandée, même pour les oligonucléotides plus courts (voir plus d’informations sur les techniques ci-dessus sur les Tests standard in vitro pour les Interactions Protéine-Acide nucléique – Tests par décalage de gel pour la liaison à l’ARN et à l’ADN et la Mutagenèse dirigée par site).
Une purification peut être nécessaire après synthèse ou après modification enzymatique de l’oligonucléotide. Il existe plusieurs méthodes pour y parvenir, et le choix dépend de la nature de l’oligonucléotide et de l’application à laquelle il est destiné.
La purification par CLHP en phase inverse est basée sur l’hydrophobicité. Il utilise une phase stationnaire non polaire et des tampons aqueux et des solvants organiques comme phase mobile pour éluer les analytes; les composés polaires sont élués en premier, tandis que les composés non polaires sont retenus. C’est la meilleure méthode pour purifier les oligonucléotides modifiés avec un groupe hydrophobe, tel que la biotine, les étiquettes de colorants fluorescents ou les conjugaisons NHS-ester. La récupération de masse est plus élevée que lors de l’utilisation de la purification de PAGE et elle se prête à la purification de plus grandes quantités d’oligonucléotides (échelle de mmoles), bien qu’elle n’élimine pas les produits incomplets de manière aussi efficace. Les cartouches de purification d’oligonucléotides, basées sur la chromatographie en phase inverse, fournissent une méthode rapide de dessalement et de purification des oligonucléotides.
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) résout les oligonucléotides en fonction de leur longueur et offre ainsi une résolution suffisante pour différencier les produits sur toute la longueur des molécules défaillantes (Atkinson et Smith, 1984). Les gels de polyacrylamide sont plus efficaces pour séparer de petits fragments d’ADN que les gels d’agarose (voir Analyse de l’ARN par électrophorèse analytique sur gel de polyacrylamide et électrophorèse sur gel d’Agarose). Le seul inconvénient des gels de polyacrylamide est qu’ils sont plus difficiles à préparer et à manipuler que les gels d’agarose. Les gels de polyacrylamide sont exécutés en configuration verticale dans un champ électrique constant. Après électrophorèse, l’oligonucléotide est élué à partir du gel et concentré, en utilisant la précipitation à l’éthanol (en savoir plus sur la précipitation des acides nucléiques sur les méthodes de purification de l’ARN – précipitation) ou la chromatographie en phase inverse. C’est la méthode de choix lorsque le pourcentage le plus élevé d’oligonucléotides complets est souhaité pour des applications exigeantes. Il est également fortement recommandé pour les oligonucléotides de plus de 30 bases. De plus, plusieurs échantillons peuvent être exécutés simultanément et aucun équipement coûteux n’est requis. Le seul inconvénient de cette technique est la faible quantité d’oligonucléotide obtenue par purification. Typiquement, les oligonucléotides sont utilisés à l’échelle de 1 µmol ou moins, et la récupération de masse après purification de PAGE est < de 50% et même inférieure dans le cas d’oligonucléotides modifiés. Néanmoins, bien que le rendement soit faible, il est satisfaisant pour la plupart des applications biochimiques.
La préparation d’oligonucléotides est chargée sur un gel de polyacrylamide dénaturant à raison d’au moins 1 mg par voie. La plage de résolution du gel dépend de la concentration en polyacrylamide. Pour les oligonucléotides courts (de 15 à 35 bases), des gels de polyacrylamide à 13-15% sont recommandés; pour les oligonucléotides plus longs (de 35 à 70 bases), des gels de polyacrylamide à 8-13% sont recommandés. Le pourcentage du gel doit être adapté au système de course. Nous utilisons généralement le système Bio-Rad Mini Protean II et exécutons des gels à 15% pour purifier les oligonucléotides de 25 bases de longueur. Après identification de la bande correcte par visualisation UV, la bande est excisée et extraite du gel.
Deux méthodes différentes de purification des oligonucléotides à partir de gels de polyacrylamide sont décrites dans ce chapitre. La méthode la plus simple est l’élution par diffusion. Ceci est basé sur le mouvement des molécules d’une région de concentration plus élevée à une région de concentration plus faible. Le résultat de la diffusion est un mélange progressif de matière. Cette méthode prend du temps mais elle ne nécessite pas trop de main-d’œuvre ni d’équipement. Fondamentalement, la bande de polyacrylamide contenant l’oligonucléotide d’intérêt est découpée en petits morceaux et recouverte d’un tampon d’élution. Après incubation, l’ADN est purifié du surnageant par précipitation à l’éthanol. Le rendement est limité, entre 20% et 70%, en fonction de la longueur de l’oligonucléotide. Plus la quantité de tampon d’élution utilisée est importante, plus l’oligonucléotide est diffusé à partir du gel.
La deuxième méthode est l’électroélution dans un sac de dialyse (McDonell et al., 1977). La pièce de gel contenant l’oligonucléotide est excisée et placée dans une poche de dialyse avec un tampon. L’application d’un courant électrique provoque la migration de l’ADN hors du gel dans le tampon de la poche de dialyse. L’oligonucléotide est récupéré de ce tampon et purifié. En utilisant cette méthode, l’oligonucléotide peut être isolé avec un bon rendement, bien que cela prenne du temps si un grand nombre d’échantillons sont purifiés en même temps, car cela nécessite l’insertion de chaque bande de gel dans des poches de dialyse individuelles. Cette méthode fonctionne également bien pour les fragments d’ADN plus gros et peut même être utilisée pour extraire l’ADN des gels d’agarose.