Médecine expérimentale et thérapeutique

Introduction

Un système d’analyse de surveillance cellulaire en temps réel (RTCA) a été précédemment développé pour la surveillance continue des cultures cellulaires adhérentes (1). Cette méthode sans étiquette et non invasive est basée sur la mesure de l’impédance électrique (indice cellulaire, IC) entre les régions interdigitées sur la base des plaques de culture tissulaire. La mesure CI fournit des informations quantitatives sur le statut biologique des cellules adhérentes. En fait, la signification de CI est le nombre de cellules de survivancesur la surface de la plaque électronique. Ces données incluent le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie en tant que profil en temps réel (2-4). RTCAsystem est connu pour un dispositif de détection précoce de la réaction cellulaire sous forme de phénotype adynamique contre certains réactifs (5).

Dans notre étude précédente, la cytotoxicité de l’imatinib dans le carcinome à cellules orales (OSCC) a été évaluée à l’aide du WST-8(5– 3-(2- méthoxy-4-nitrophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-tétrazole-3-ium) comme mesure ponctuelle (6), puis plus tard avec un système RTCA (7).Les mesures des paramètres par MTT (bromure de 3–2,5-diphényltétrazolium) et les tests WST-8 sont couramment utilisés pour évaluer la cytotoxicité. Cependant, de tels essais sont limités par des variations des effets de différents agents anticancéreux sur différentes lignées cellulaires. De plus, les valeurs de la CI50 calculées par des dosages in vitro des paramètres ont tendance à être plus élevées que les concentrations effectives in vivo (8,9).

Dans notre étude précédente, les valeurs de la CI50 mesurées par le système RTCA étaient inférieures à celles mesurées par le test WST-8, suggérant que le système RTCA peut évaluer de manière sensible la cytotoxicité et l’influence de l’imatinib sur l’adhérence cellulaire. Cependant, il n’est pas clair si l’évaluation des valeurs IC50 d’autres agents anticancéreux à l’aide du système RTCAS serait utile car il existe des différences dans les réactions cytotoxiques entre les médicaments cibles moléculaires tels que l’imatinib et les agents anticancéreux au fil du temps.

Dans cette étude, nous devons sélectionner certains types de lignées cellulaires afin de déterminer la différence de profil de réaction cellulaire par rapport aux réactifs anticancéreux en temps réel à l’aide du système RTCA.La lignée cellulaire SQUU-A non invasive et la lignée cellulaire SQUU-B invasive qui ont été établies à partir de tumeurs cancéreuses récurrentes locales de la langue chez un patient unique ont été sélectionnées parce que nous étions engagés dans des recherches sur les métastases de la lignée cellulaire SQUU-B en utilisant la lignée cellulaire SQUU-A et la lignée SQUU-Bcell (10-12). La lignée cellulaire SAS a été établie à partir de carcinome épidermoïde humain malpighien fortement différencié de la langue (13). La lignée cellulaire NA a été établie en tant que lignée cellulaire productrice de fibronectine (14). En outre, il a été rapporté que la cytotoxicité des réactifs anticancéreux dans l’OSCC a été évaluée dans les lignées cellulaires SQUU-A et SQUU-B (15), la lignée cellulaire SAS (16), la lignée cellulaire NA (17) en utilisant diverses méthodes conventionnelles.C’est pourquoi, nous avons sélectionné quatre lignées cellulaires avec chacune des caractéristiques de la présente étude, qui ont également été utilisées dans le test cytotoxique lors d’une étude précédente.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur un nouveau dispositif RTCA développé pour la mesure en temps réel et avons évalué les valeurs IC50 comme une échelle pour évaluer la cytotoxicité de nos agents anticancéreux dans quatre lignées cellulaires OSCC. Cela nous a permis d’obtenir des informations sur les variations observées entre les différents réactifs anticancéreux et lignées cellulaires en temps réel.

L’objectif de la présente étude était d’obtenir des profils IC50 à partir d’agents anticancéreux immédiatement après l’ajout en utilisant un système RTCA. Cette étude a démontré l’avantage d’évaluer la cytotoxicité des agents anticancéreux à l’aide d’un système RTCA par rapport à un test de point final.

Matériaux et méthodes

Réactifs et matériaux

Le 5-Fluorouracile (5-FU) a été dilué dans de l’indiméthylsulfoxyde de 100 mM (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., Saint-Louis, MO, États-Unis).La Doxifluridine et le carboplatine ont été dilués à 100 et 50 mM, respectivement, dans de l’eau distillée. Le docétaxel a été dilué dans 10 mm d’éthanol. Tous les réactifs anticancéreux proviennent de Wako PureChemical Industries, Ltd., (Osaka, Japon) et conservé à -20°C.

Culture cellulaire

Lignées cellulaires OSCC humaines SQUU-A, SQUU-B, SAS et NAwere dérivées d’échantillons de langue humaine. SQUU-A et SQUU-B, fournis par Morifuji-Wilson M (Université de Kumamoto, Kumamoto, Japon), ont été établis à partir de tumeurs locales récurrentes du cancer du langage (18). SAS (13,19,20) a été acheté auprès de la Banque de cellules Riken BRC (Tsukuba, Japon). NA (14) a été gentiment fournie par le Dr.Jun- Iw Iwata (Université de Kyushu; Fukuoka, Japon). Toutes les lignes cellulaires ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japon) contenant 10% de sérum de veau foetal (Biowest, Nuaille, France) à 37°C en atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.

Mesure de la prolifération des cellules osccpar le test de cytotoxicité RTCA

CI a été acquis par le système iCELLigence (ACEABiosciences, Inc., San Diego, Californie, États-Unis) en tant que système RTCA. Tous les contrôles ont été effectués à 37°C avec une teneur en CO2 régulée (5%). Des plaques E (plaques de culture pour le système iCELLigence) contenant 200 µl de milieu de culture par puits ont été équilibrées à 37°C, et l’IC a été mis à zéro dans ces conditions. Des cellules (2×104 cellules/puits sauf indication contraire) ont été ajoutées dans 560 µl de milieu de culture Des agents anticancéreux ont été ajoutés 24 h après l’ensemencement des cellules. L’IC a été surveillé en temps réel pendant 96 h après l’ensemencement. Les valeurs de la CI50 ont été calculées par le logiciel d’analyse RTCAData version 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

La concentration en huit points de quatre agents anticancéreux a été établie sur la base des valeurs de Cmax de l’étude précédente (21-25). De plus, des points de temps ont été fixés pendant 72 h, dont 24 h et 48 h, qui étaient une méthode générale pour évaluer la cytotoxicité dans le test du point final.

Ajustement de la courbe des données CI50

Nous avons utilisé la formule dose-réponse sigmoïdale suivante pour calculer les valeurs CI50: Y = CI faible + (CI élevé – CI faible) / {1 + 10 ^ (Log IC50-X)}, où ‘CI Faible’ représente les valeurs CI minimales, ‘CI élevé’ représente les valeurs d’indice de cellule maximales, Y est l’indice de cellule et X est le log de concentration (M).

Mesure de la prolifération des cellules OSCCPAR le test WST-8

Après l’ensemencement initial et la culture des cellules OSCC, le milieu de culture a été retiré et remplacé par un milieu contenant des agents anticancéreux. Après 24, 48 et 72 h d’incubation, un colorant WST-8 de 20 µl (Kit de comptage cellulaire-8; Dojindo Corporation, Tokyo, Japon) a été ajouté à chaque puits. Après 3 h, les plaques ont été lues à 450 nm / 655 nm. Le taux de survie cellulaire a été calculé en utilisant la formule ci-dessous (7). Les valeurs de la CI50 ont été calculées par régression par approximation linéaire de la survie en pourcentage par rapport à la concentration du médicament.

Taux de survie cellulaire (%) = (a-c)/ (b-c) ×100 (a= absorbance à chaque concentration du réactif anticancéreux, b = absorbance à 0 µM du réactif anticancéreux et c = absorbance de l’ébauche).

Analyse statistique

Toutes les données sont présentées comme la moyenne ± écart type (SD) de trois expériences indépendantes. Les corrélations entre les valeurs d’IC50 obtenues à l’aide du système RTCA et le test WST-8 ont été évaluées pour leur signification statistique par le Spearmantest. Les valeurs à deux queues de P < 0,05 ont été considérées comme attribuables.

Résultats

Effet de la concentration de l’agent anticancéreux sur la prolifération des cellules OSCC à l’aide du système RTCA

Nous avons évalué la cytotoxicité de quatre agents anticancéreux (5-FU, doxifluridine, carboplatine et docétaxel) dans quatre lignées cellulaires de CCC en surveillant les valeurs d’IC pendant 96 h après l’ensemencement des cellules à 2×104 cellules/puits sur plaques E (Fig. 1–4). Les valeurs d’IC ont été diminuées de manière dépendante de l’adose dans les quatre lignées cellulaires OSCC. Par conséquent, la réduction des valeurs d’IC est corrélée à la diminution de la cellule number.As représenté à la Fig. 2, la valeur CI pour la lignée cellulaire SQUU-B invasive était inférieure à celle des autres OSCC cells.As représenté à la Fig. 3, Le profil CI obtenu pour la lignée cellulaire SAS a montré une augmentation retardée après 48 h. 4, le taux de prolifération et la valeur maximale de CI dans la lignée cellulaire NA étaient supérieurs à ceux des autres lignées cellulaires.

Mesure en temps réel des profils IC50 des agents anticancéreux dans les cellules OSCC à l’aide du système RTCA

Les profils IC50 des quatre agents anticancéreux dans les quatre lignées cellulaires OSCC ont été déterminés par le système RTCAS et calculés par le logiciel commercial fourni avec l’instrument (un sous-ensemble des données SQUU-B est représenté à la Fig. 5). Les valeurs de la CI50 ont été indiquées pendant 72 h après l’ajout d’agents anticancéreux. Les valeurs Ic50 à 24, 48 et 72 h pour les quatre lignes cellulaires sont résumées dans les tableaux I-IV. Comme le montre la Fig. 5, il y avait un décalage dans le temps dans les réactions cytotoxiques du 5-FU (Fig. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Tandis que, les courbes de viabilité cellulaire de la SQUU-B utilisant le test WST-8 ont également été montrées dans des matériaux supplémentaires (Fig. S5-S8). Les valeurs de R2 à 72 h après l’ajout de réactifs anticancéreux dans le test WST-8 étaient faibles dans quatre réactifs anticancéreux par rapport à l’un des réactifs de 24 h et 48 h. Ces résultats ont montré qu’il est souhaitable que le test au point final soit effectué à 24 h ou 48 h pour être utilisé comme protocole général. Dans cette étude, les courbes de viabilité cellulaire de l’essai WST-8 ont été montrées dans des matériaux supplémentaires car il n’y avait aucune nouveauté dans le calcul des valeurs de la CI50 à l’aide de l’essai WST-8.

Corrélations entre les mesures en temps réel des valeurs d’IC50 à l’aide du système RTCA et les mesures ponctuelles des valeurs d’IC50 à l’aide du test WST-8 dans des cellules OSCC

Comme le montre la Fig. 6, Les valeurs IC50 à 24, 48 et 72 h en utilisant deux méthodes ont été représentées. L’axe horizontal affiche les valeurs IC50 en temps réel mesurées à l’aide du système RTCA, tandis que l’axe longitudinal affiche les valeurs IC50 de point final mesurées à l’aide du test WST-8. Une corrélation positive a été observée entre les deux types de méthode de dosage pour mesurer la CI50 pour chaque agent anticancéreux.Les résultats de la 5-FU, de la doxifluridine, du carboplatine et du docétaxcelont été y = 8,19 x + 346,02 (R2 = 0,94, rs = 0,66, *P < 0,05), y = 1,00 x + 172,70 (R2 = 0,91, rs = 0,82, **P < 0,01), y = 1,90x + 206,81 (R2 = 0,92, rs= 0,96, **P < 0,01), andy = 13,53x + 0,08 (R2 = 0,95, rs=0,73, *P < 0,05), respectivement. Les valeurs EIC50 en temps réel avaient tendance à être inférieures aux valeurs IC50 du point final correspondant.

Discussion

Les valeurs CI calculées par le RTCA représentent également l’état de la cellule (3). Voir sur les Figues. 1-5, les valeurs SD des valeurs CI étaient trop petites pour être vues. Par exemple, toutes les valeurs SD de la Fig.1 était inférieur à 0,05. La raison des faibles valeurs d’IC de SQUU-B était que la protéine d’adhésion E-cadhérine joue un rôle essentiel dans les métastases, avec des niveaux réduits d’E-cadhérine favorisant la migration cellulaire et l’invasion cellulaire (26). La raison des valeurs maximales d’IC élevées de l’ARN a été suggérée qu’il a été rapporté que la fibronectine a accéléré la prolifération et l’adhésion cellulaires en raison de la caractéristique de la lignée cellulaire de l’ARN en tant que lignée cellulaire productrice de fibronectine (6). Ainsi, les réactions cellulaires de chaque lignée cellulaire contre quatre réactifs anticancéreux étaient variables. Nous n’avons pas pu trouver la relation causale entre les valeurs de la CI50 et la caractéristique des lignées cellulaires dans cette étude. Cependant, il est important de détecter une réaction cellulaire en temps réel en tant que profil d’IC pour évaluer la cytotoxicité du réactif anticancéreux lors de l’examen de l’application pharmaceutique à l’homme.

Le profil IC50 de la lignée cellulaire SQUU-B a été décrit à la Fig. 5 en tant que profil IC50 représentatif, car il n’y avait pas de différences dans le profil IC50 dans la même lignée cellulaire dans le cas du même réactif, bien que nous ayons calculé les valeurs IC50 dans toutes les lignées cellulaires en utilisant quatre réactifs anticancéreux. Nous avons constaté que les profils IC50 variaient pour chaque agent anticancéreux et dans chaque lignée cellulaire OSCC. Comme le montre la Fig.Le 5, 5-FU et le docétaxel ont nécessité plus de 24 h (48 h dans la figure) pour commencer à exercer un effet cytotoxique sur les cellules OSCC, alors que les valeurs de la CI50 s’étaient rétablies à partir d’environ 24 h (48 h sur la figure) après l’ajout de doxifluridine et de carboplatine. Ainsi, nous avons suggéré que les différences de profils en temps réelIC50 étaient causées par un réactif anticancéreux. De telles observations n’auraient pas été possibles sans une mesure en temps réel à l’aide du RTCA. La surveillance en temps réel des valeurs de l’IC50 a également révélé que ces valeurs changeaient remarquablement au fil du temps. Il est possible de ne pas détecter les changements en utilisant des méthodes conventionnelles, car un seul point temporel de la CI50 après le traitement par l’agent anticancéreux est évalué par un test de point final.

Le système RTCA est différent des tests finaux traditionnels car la mesure de l’impédance est non invasive et peut fournir des données quantitatives de haute qualité sur la cytotoxicité de manière continue. Comme le montre la Fig.6, il y avait des corrélations positives significatives entre les valeurs d’IC50 obtenues avec le système RTCA et l’essai WST-8, même s’il y avait quelques différences dans les valeurs absolues d’IC telles que les faibles valeurs d’IC obtenues pour la lignée cellulaire SQUU-B. Ces résultats ont suggéré que même un faible IC obtenu pour certaines lignescellulaires serait en mesure d’évaluer la cytotoxicité haute sensibilité dans le système RTCAS. Tandis que les valeurs IC50 en temps réel étaient inférieures aux valeurs IC50 en temps réel lorsque les valeurs IC50 en temps réel obtenues avec le système RTCA ont été comparées aux valeurs IC50 en temps réel obtenues avec le test WST-8.Ces résultats suggèrent que le système RTCA peut être utilisé pourévaluer de manière sensible l’effet des agents anticancéreux sur la prolifération cellulaire et l’adhésion.

Dans le système RTCA, la cellule adhérente agit comme un isolant sur la surface de l’électrode et modifie le milieu ionique de la solution d’électrode, augmentant l’impédance (27). Ainsi, CI est fonction du nombre de cellules et du rapport des cellules à différents intervalles de temps. CI = 0 lorsqu’il n’y a pas d’adhérence cellulaire (5). Les CIchanges décrits par le système RTCA reflètent le phénotype dynamique de la cellule. Cette surveillance dynamique de l’interaction cellule-médicament nous permet d’obtenir une meilleure compréhension des effets temporels de l’initro, en particulier immédiatement après le traitement médicamenteux (28). La caractéristique cinétique des cellules offre des informations perspicaces qui ne peuvent pas être acquises à partir d’un essai conventionnel à un seul point final tel que le test WST-8. Alors que les résultats du test WST-8 se reflètent dans la réaction métabolique de survivalcell (29). La toxicité à l’aide de l’essai WST-8 pourrait être sous-estimée si la réaction métabolique cellulaire était maintenue bien que la réaction cellulaire dynamique ait eu lieu. Nous avons suggéré que ces différences de principe dans deux méthodes étaient induites par d’énormes différences de valeur IC50 jusqu’à 8 fois entre deux méthodes, comme le montre la Fig. 6A. Notre étude précédente a rapporté que la CI50 de l’imatinib dans les cellules SQUU-acells calculées par le système RTCA et le test WST-8 était de 4 µM et 60 µm, respectivement (sensibilité de 15 fois) (6,7). D’autres groupes de recherche ont rapporté que la CI50 du cisplatine dans les cellules HK-2 calculées par le système RTCA et le test WST-8 était de 0,76 µM et 25 µm, respectivement (sensibilité de 33 fois) (30,31).Ces données précédentes soutenaient nos données pour montrer leur validité.

Il est important d’obtenir des mesures immédiatement après le traitement avec des agents anticancéreux pour évaluer à la fois les effets secondaires des agents et ses effets souhaités. Cependant, il existe peu de rapports de méthodes utiles qui mettent en corrélation les données invitro avec les données humaines in vivo. Nous avons considéré que la mesure en temps réel à l’aide du système RTCA profiterait à l’évaluation des effets secondaires des agents anticancéreux dans les cellules normales.

Les valeurs de Cmax précédemment rapportées pour le 5-FU, la doxifluridine, le carboplatine et le docétaxel sont les suivantes 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), et 2 µM (24,25), respectivement, lorsqu’ils sont utilisés pour un traitement intraveineux chez l’homme. Nosdonnées étaient en corrélation avec les données humaines parce que les valeurs Cmax étaient incluses dans la gamme des doses expérimentales utilisées dans cette étude.

Les systèmes RTCA sont le nouveau dispositif principal pour évaluer la cytotoxicité, qui utilisent l’intensité d’impédance de la celladhésion et non l’activité enzymatique dans les cellules cibles telles que le test MTT. Les valeurs de la CI50 des agents anticancéreux calculées par le système RTCA ont été significativement corrélées avec les niveaux de la CI50 calculés par l’analyse conventionnelle des paramètres. De plus, le système RTCA a obtenu des mesures automatiquement en temps réel immédiatement après le traitement avec des agents anticancéreux.

En fait, le système RTCA ne peut pas évaluer directement la cytotoxicité du béton telle que la mort cellulaire ou l’apoptose, etc., car l’indice cellulaire a été calculé en fonction de l’impédance. C’est pourquoi, le test de combinaison entre le système RTCA et la mesure de la mort cellulaire pourrait être une méthode efficace en cas d’évaluation de la réaction cellulaire du béton telle que la mort cellulaire ou l’apoptose précisément.Par exemple, la coloration à l’annexine V ou l’expression du test de caspase-3pour la détection de l’apoptose, le test de libération de la lactate déshydrogénase (LDH) pour la détection de la mort cellulaire pourrait être des méthodes efficaces (32,33). En outre, il pourrait être utile d’évaluer l’expression de la protéine inflammatoire dans les cellules normales pour détecter les effets secondaires lorsque le réactif anticancéreux a été ajouté aux cellules normales ensemencées sur la plaque électronique. La surveillance dynamique en temps réel pendant la culture de la cellule, y compris les réactifs anticancéreux, peut fournir des informations précieuses pour la détection précoce de l’efficacité thérapeutique et de l’effet secondaire, qui ne peuvent pas être évalués dans les méthodes conventionnelles de dosage final. Ainsi, la valeur IC50 calculée par le système RTCA peut être un paramètre utile pour le dépistage du point de vue de la mesure en temps réel automatisée, l’évitement des problèmes colorimétriques ou de la contamination. De plus, le système RTCA permet l’analyse de toute la période de l’expérience et ne nécessite pas de marquage pouvant affecter négativement les expériences de culture cellulaire.

La nouveauté de cette étude est que le système RTCA pourrait détecter une cytotoxicité à haute sensibilité par rapport à une méthode conventionnelle, le test WST-8. De plus, le système RTCA pourrait évaluer précieusement la valeur de 50 en temps réel sans restriction de période expérimentale pendant au moins 72 h après l’ajout de réactifs anticancéreux.

En conclusion, nos résultats ont démontré que les systèmes RTCAS sont utiles pour le dosage de la cytotoxicité et pourraient être utilisés dans le développement futur d’agents chimiothérapeutiques à l’aide de cellules cancéreuses et l’évaluation de leurs effets secondaires dans les cellules normales. De plus, un système RTCA peut être utilisé pour évaluer les profils de réaction cellulaire, tels que la thérapie combinée et les interactions anticorps-cellules ou médicament-médicament, des réactifs anticancéreux.

Matériel supplémentaire

Données à l’appui

Remerciements

Sans objet.

Financement

Aucun financement n’a été reçu.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur reasonablequest.

Contributions des auteurs

MH et MN ont conçu et conçu l’étude. MH et TN ont effectué les expériences et acquis les données. MH a analysé lesdonnées, préparé les chiffres et rédigé le manuscrit. MH, TKY et MN ont interprété les résultats. MH et TKY ont édité et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la finalemanuscrit.

Approbation éthique et consentement àparticiper

Sans objet.

Consentement du patient à la publication

Sans objet.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

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