L’hyperpolarisation présynaptique induit une modulation analogique rapide de la transmission évoquée par des pics médiée par des canaux sodiques axonaux

Facilitation de la DA induite par l’hyperpolarisation

Nous avons d’abord mesuré l’incidence d’une brève hyperpolarisation de la cellule présynaptique sur une transmission synaptique. Des paires de neurones CA3 monosynaptiquement connectés ont été enregistrées dans des cultures organotypiques de l’hippocampe de rat après 8 à 10 jours in vitro (DIV) 21. Une pré-impulsion hyperpolarisante de 200 ms délivrée avant le pic présynaptique augmentait la force synaptique de ∼20% (Fig. 1 bis). Cette augmentation a été observée lors de la mesure de l’amplitude ou de la charge de la réponse postsynaptique (Fig. 1). Dans ces expériences, le potentiel de repos présynaptique était de -74±3 mV (n = 10). Le h-ADF était comparable lorsque l’hyperpolarisation présynaptique s’élevait à -84 ou -102 mV (respectivement, 124±8 % contre 119±5 %, n = 10 ; Test de Wilcoxon P > 0.1), suggérant qu’une hyperpolarisation présynaptique de ∼10 mV est suffisante pour obtenir du h-ADF saturant. le h-ADF était associé à un rapport d’impulsions appariées réduit (PPR, de 99±7 à 88±5%, n = 12; Test de Wilcoxon P < 0,05; Supplémentaire Fig. 1), indiquant qu’il résulte d’une augmentation présynaptique de la libération de glutamate.

Une hyperpolarisation de 200 ms de long est peu susceptible de se produire dans un contexte physiologique. Par conséquent, nous avons étudié l’évolution temporelle de h-ADF pour des hyperpolarisations plus courtes (15, 50, 100 et 200 ms). l’h-ADF a été observé pour toutes les durées d’hyperpolarisation testées (15 ms : 111±3%, 50 ms : 116±4%, 100 ms : 109±4%, 200 ms : 120±6% Wilcoxon, P < 0,05 pour toutes les durées, n = 7, Fig. 1b). Selon ce résultat, l’h-ADF est susceptible d’être induite par une hyperpolarisation physiologique.

Les neurones pyramidaux CA3 expriment la facilitation de la DA induite par la dépolarisation (d-ADF) qui résulte de l’inactivation lente des canaux Kv1.1 (constante de temps: 3,3 s)13. Nous avons donc examiné si le d- et le h-ADF étaient exprimés aux mêmes connexions CA3-CA3. Les AP présynaptiques ont été déclenchés alternativement à partir d’un potentiel membranaire au repos (contrôle de -78 mV), après une longue dépolarisation du sous-seuil (10 s, -62,6 mV, d-ADF), après une brève hyperpolarisation (200 ms, -96,1 mV, h-ADF) ou après la combinaison d’une longue dépolarisation et d’une brève hyperpolarisation (d- et h-ADF; Fig. 1c, à gauche). En effet, la combinaison des deux formes d’ADF a produit, dans les mêmes connexions, une plus grande facilitation (113±3%, n = 16 ; Fig. 1c) que celle produite séparément par chaque protocole (d-ADF seul: 105±3%, n = 16, h-ADF seul: 108±4%, n = 11; Fig. 1c). Il a notamment été constaté que les FAD h et d moyennes se résument linéairement, suggérant deux mécanismes moléculaires indépendants. De plus, d- et h-ADF mesurés dans les mêmes paires ont été corrélés positivement (Fig. 1), suggérant que certaines connexions synaptiques sont plus sensibles à la facilitation AD, probablement parce que la propagation du signal analogique le long de l’axone dépend de la distance entre le soma et les terminaux présynaptiques. Ces données démontrent que h- et d-ADF coexistent dans les neurones pyramidaux CA3 et que les mécanismes sous-jacents sont susceptibles d’être indépendants.

le h-ADF a été observé dans de jeunes neurones CA3 (DIV8–10 préparés à partir de rats P5–P7), et il pourrait donc principalement résulter de la faible densité ou des propriétés immatures des canaux ioniques à déclenchement en tension. Nous avons donc déterminé si le h-ADF était également présent dans des cellules pyramidales matures en CA3. Des enregistrements appariés de neurones CA3 connectés ont été obtenus dans des cultures en tranches DIV24–DIV32. Brève hyperpolarisation présynaptique (200 ms) augmentation significative de la force synaptique (104.2±1,1% n = 25; Wilcoxon, P < 0,01; Fig. supplémentaire. 2). l’h-ADF mesuré dans les cellules matures était plus petit que celui mesuré dans les neurones en développement (Mann-Whitney, P< 0,01; Fig. supplémentaire. 2). Nous concluons donc que le h-ADF est régulé au niveau du développement dans les neurones CA3 in vitro.

Tous les enregistrements ont été obtenus avec une teneur élevée en calcium extracellulaire (3 mM) pour optimiser la force synaptique. Dans ces conditions, la probabilité de libération présynaptique est élevée et la facilitation présynaptique telle que h-ADF pourrait être sous-estimée. Nous avons donc mesuré h-ADF dans des neurones CA3 matures (DIV24–DIV32) enregistrés avec du calcium extracellulaire physiologique (1,3 mM)22. Dans ces conditions, le h-ADF s’est avéré être d’environ +16,4% (Wilcoxon, P< 0,01; Fig. supplémentaire. 2). Nous concluons que le h-ADF est exprimé de manière robuste dans les neurones matures enregistrés dans le calcium extracellulaire physiologique.

le h-ADF est induit par des IPSP et des oscillations simulées

Pour étudier le rôle du h-ADF dans des conditions quasi physiologiques, une conductance de type GABAA a été introduite dans le neurone présynaptique à l’aide d’une pince dynamique (Fig. 2a, à gauche). En accord avec les résultats illustrés à la Fig. 1, Les AP précédés de l’injection d’un courant de type IPSC ont produit une réponse plus importante dans le neurone postsynaptique par rapport aux aps déclenchés à partir du potentiel de membrane au repos (Wilcoxon P < 0,001, n = 11). En accord avec une élévation présynaptique de la libération de glutamate, la PPR a été réduite lorsque les IPSP GABAergiques simulées précédaient les APs (de 121% dans le contrôle à 96%; Wilcoxon P < 0,05, n = 7; données non présentées). Il est intéressant de noter que la taille de la potentialisation synaptique dépend de la taille de l’IPSP simulé (R2 = 0,39, P < 0,05), indiquant que le h-ADF est évalué entre le potentiel de membrane au repos (-74 mV) et l’hyperpolarisation de 10 mV (-84 mV; Fig. 2a, à droite). En fait, le facteur de facilitation dans cette gamme s’est avéré être de 1,8% par mV d’hyperpolarisation.

Nous avons ensuite étudié la modulation de la force synaptique pendant l’oscillation du potentiel membranaire présynaptique. L’oscillation du potentiel de membrane présynaptique à 4 Hz a été produite par injection de courant sinusoïdal, et des pics présynaptiques uniques ont été évoqués à différentes phases de l’oscillation. En accord avec les résultats précédents, du h-ADF a été observé lorsque la cellule s’est mise à feu pendant les phases d’hyperpolarisation de l’oscillation (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon P < 0,05, n = 8; Fig. 2b). Aux autres phases, la force synaptique est inchangée (56 ms: 112,2 ±6%, 163 ms: 95,8 ±5%, 211 ms: 110,5 ±6%, Wilcoxon P > 0,1, n = 8). En particulier, aucun d-ADF n’est observé avec la dépolarisation car sa durée est trop courte pour inactiver les canaux Kv1.113. Nous concluons que les oscillations dans la gamme θ induisent h-ADF dans les neurones CA3.

le h-ADF est associé à une augmentation de l’amplitude du pic axonal

Ensuite, nous avons étudié les mécanismes sous-jacents au h-ADF. Un mécanisme possible pour h-ADF est une modulation de l’amplitude du pic présynaptique induite par l’hyperpolarisation. Nous avons donc examiné la conséquence de l’hyperpolarisation sur l’amplitude du pic mesurée dans l’axone. Les neurones CA3 ont été remplis d’Alexa 488 (50 µM) pour visualiser l’arborisation de l’axone, et des enregistrements liés aux cellules ont été obtenus à partir de l’axone à des distances comprises entre 60 et 240 µm (Fig. 3 bis). Sur l’hyperpolarisation somatique, l’amplitude du pic axonal a été augmentée (106±1% de l’amplitude de contrôle, n = 6, Wilcoxon, P < 0,05; Fig. 3b). Cependant, l’amplitude de la facilitation du pic axonal diminue avec la distance axonale avec une constante d’espace de 212 µm (Fig. 3b). En conclusion, h-ADF dans les neurones CA3 est associé à une augmentation locale de l’amplitude du pic dans l’axone.

Bien que l’enregistrement de cellules entières à partir d’axones CA3 soit extrêmement difficile dans les cultures organotypiques, il peut être obtenu dans les neurones pyramidaux L5 à partir de tranches aiguës 5,6. Par conséquent, nous avons d’abord mesuré si le h-ADF pouvait également être observé aux connexions excitatrices L5–L5. Des paires de neurones pyramidaux L5 monosynaptiquement connectés ont été enregistrées en tranches aiguës du cortex sensori-moteur de jeunes rats (P14–P20). Une brève hyperpolarisation dans le soma (200 ms, 10-15 mV) du neurone présynaptique améliore la force synaptique (109,6 ±2,3%, n = 13, Test de Wilcoxon, P < 0,05; Fig. 4 bis).

Pour confirmer que le h-ADF dans les neurones pyramidaux L5 était associé à une augmentation de l’amplitude du pic axonal, des enregistrements simultanés de cellules entières à partir du soma et des axones d’extrémité coupée (blebs) ont été obtenus (50-80 µm à partir du soma) dans les neurones pyramidaux L5. L’hyperpolarisation transitoire du soma (environ -13 mV) a augmenté l’amplitude du dépassement du pic dans l’axone mais pas dans le soma (+5,5±1,5 versus -0,3±1,1 mV, n = 5, Mann–Whitney, P < 0,05; Fig. 4b). La vitesse de dépolarisation a également été augmentée (de 251±59 à 289±56 mV ms−1, n = 5) et le seuil de pic a été hyperpolarisé (de -35,7±5,2 à -38,8±4,3 mV, n = 5). Nous concluons que le h-ADF dans les cellules pyramidales CA3 et L5 est associé à l’augmentation de l’amplitude du pic mesurée dans l’axone.

le h-ADF est associé à des signaux calciques axonaux améliorés

Nous avons ensuite utilisé l’imagerie Ca2 + pour déterminer la conséquence de l’amélioration de l’amplitude du pic induite par l’hyperpolarisation dans l’axone. Les neurones pyramidaux CA3 ont été remplis d’Alexa-594 de 50 µm; des signaux de calcium évoqués Fluo-4 et spike de 250 µM ont été mesurés dans des boutons putatifs en passant à des distances comprises entre 150 et 250 µm du soma (Fig. 5 bis). L’intégrale du transitoire Ca2+ évoqué par le pic a été augmentée lorsque le pic présynaptique a été évoqué suite à une hyperpolarisation transitoire de ∼20 mV (126±10%, n = 5; Fig. 5b). Nous concluons que, au cours de l’h-ADF, l’hyperpolarisation présynaptique améliore à la fois l’amplitude du pic présynaptique et l’afflux de Ca2+ induit par le pic, ce qui améliore ensuite la libération de glutamate.

L’inactivation du canal Nav dans l’axone détermine h-ADF

L’amplitude accrue du pic axonal pendant l’hyperpolarisation pourrait être due à la récupération des canaux Nav de l’inactivation. Pour confirmer le rôle de l’inactivation des canaux sodiques dans l’h-ADF, nous avons utilisé un modèle NEURONAL de deux neurones CA3 monosynaptiquement connectés. Nous avons ensuite déterminé l’incidence de l’inactivation modifiée des canaux sodiques dans l’axone sur l’h-ADF. Lorsque la demi-inactivation des canaux sodiques axonaux était réglée à -80 mV (refs 18, 19), l’hyperpolarisation somatique augmentait l’amplitude du pic, la charge du courant calcique évoqué par le pic et la transmission synaptique (Fig. 6a, à gauche). Cela est dû à la récupération des canaux Nav de l’inactivation par hyperpolarisation (Fig. 6b, à gauche). Cependant, aucun changement ne s’est produit si la demi-inactivation des canaux sodiques axonaux était réglée à -70 mV (Fig. 6a, à droite). Dans ce dernier cas, la proportion de canaux Nav disponibles est déjà très élevée au potentiel de membrane de repos, produisant un AP de pleine amplitude (Fig. 6a, b, à droite). Par conséquent, la récupération de l’inactivation n’affecte pas davantage l’amplitude du pic présynaptique. Ainsi, h-ADF dans le modèle est dû à la récupération des canaux Nav de l’inactivation et est augmenté en hyperpolarisant la demi-inactivation Nav (Fig. 6c).

De plus, nous avons utilisé notre modèle NEURONAL pour simuler la disponibilité du canal Nav axonal lors d’une oscillation thêta similaire à celle utilisée à la Fig. 2 ter. On a constaté que les canaux Nav s’inactivaient pendant la dépolarisation et se rétablissaient pendant l’hyperpolarisation, ce qui explique la modulation EPSC pendant l’oscillation (Fig. supplémentaire. 4). Cependant, l’inactivation est plus rapide que la récupération pendant l’oscillation en raison de la cinétique de Nav plus lente aux potentiels dépolarisés (Fig. 4). Ceci explique pourquoi les EPSCS produits à 163 ms ne présentaient aucun h-ADF, bien que le pic soit émis à partir d’un potentiel légèrement hyperpolarisé (Fig. 2b). En fait, à ce stade de l’oscillation, les canaux Nav n’avaient pas assez de temps pour se remettre de l’inactivation (Fig. 4).

Dans l’ensemble, ces résultats confirment le fait que le h-ADF est dû à la récupération des canaux Nav de l’inactivation.

La densité des canaux Nav détermine la force du h-ADF

le h-ADF dépend de la disponibilité des canaux sodiques dans l’axone. Ainsi, la réduction de la densité des canaux Nav devrait affecter h-ADF. En fait, notre modèle a montré que la réduction de la densité de canal Nav à 70% de la condition de contrôle augmentait le h-ADF de 130 à 180% (Fig. 7 bis). Le paramètre critique ici était le gain de dépassement du pic présynaptique qui dépend de la conductance de Na activable (Fig. 7b). En condition de contrôle, cette valeur était déjà élevée et l’hyperpolarisation de l’élément présynaptique de -78 à -93 mV augmentait l’amplitude du pic de 28%. Lorsque la densité de Nav a été réduite, la même hyperpolarisation a augmenté l’amplitude de l’AP présynaptique de 42%.

Nous avons ensuite vérifié expérimentalement que la réduction de la densité des canaux Nav augmentait l’h-ADF dans les neurones CA3. Nous avons donc partiellement bloqué les canaux Nav avec une faible concentration de tétrodotoxine (TTX) appliquée dans le bain (15-25 nM). A cette concentration, TTX bloque ∼80% du courant Na+ mais préserve l’induction des pointes Na+rapides24,25. En présence de TTX, l’amplitude du pic dans le soma a été réduite de 45 ±4% (n = 9) et la transmission synaptique aux connexions CA3-CA3 a été réduite de 55 ±8% (n = 9; Fig. supplémentaire. 5). Plus important encore, la réduction de la proportion de canaux Nav activables avec 15-25 nM de TTX a permis d’améliorer considérablement le h-ADF dans les neurones matures n’exprimant pas de h-ADF (de 103 ±3% chez le contrôle à 121 ±4% en présence de TTX, n = 6, Wilcoxon P < 0,05; Fig. 7c, d). Ces données confirment donc que le h-ADF dans les neurones CA3 dépend de la disponibilité des canaux Nav.

Des canaux Ca2+ de type T sont présents dans l’axone. Ils pourraient être activés au cours de la séquence d’hyperpolarisation–dépolarisation utilisée pour induire le h-ADF et peuvent donc expliquer le h-ADF. Cependant, le h-ADF s’est avéré stable en présence de mibefradil à 100 nM, un bloqueur de canaux de type T (de 112,2 ±1,1% dans le contrôle à 116,2 ±11,9% avec le mibefradil, n = 3; données non montrées), suggérant que les canaux Ca2+ de type T ne participent pas au h-ADF.

l’ADF-h favorise la synchronisation du réseau

Nous avons ensuite testé l’implication de l’ADF-h dans la synchronisation du réseau en utilisant un modèle de réseau hippocampique formé de 80 cellules excitatrices de type pyramidal (cellules e) et de 20 cellules inhibitrices de type interneurone (cellules i) interconnectées (Fig. 8a; voir Méthodes). les cellules e et i ont été alimentées par un apport stochastique. Le réseau de cellules e est devenu synchronisé et les oscillations dans la gamme gamma sont apparues à mesure que la force synaptique entre les cellules e augmentait (Fig. supplémentaire. 6). Ces oscillations étaient pilotées par les i-cells : l’activation des e-cells favorisait l’activation des i-cells, ce qui réduisait au silence l’ensemble du réseau (Fig. 6). Puisque le h-ADF augmente la force synaptique interpyramidale lorsque le pic présynaptique est précédé d’un IPSP, le h-ADF est un bon candidat pour promouvoir ces oscillations entraînées par les cellules i.

La règle h-ADF a été incorporée dans le réseau en augmentant la force synaptique entre les cellules e en fonction du potentiel membranaire mesuré 17 ms avant le pic. En effet, la force synaptique était augmentée de 20% si le potentiel présynaptique était inférieur à -84 mV (Fig. 8b). Cette règle est directement dérivée des valeurs mesurées expérimentalement (voir Figures 1a et 2a). Pour une force synaptique des cellules e de 2,8 mS, l’ajout de h-ADF dans le réseau a nettement amélioré à la fois la fréquence de déclenchement et la synchronie entre les cellules e (Fig. 8c-e). En fait, la propension à osciller dans la gamme gamma était grandement facilitée si l’ADF-h entre les cellules e était efficace (Fig. 8e). Fait intéressant, dans un réseau avec inhibition de shunting (ECl = -73 mV au lieu de -80 mV en condition de contrôle), la règle h-ADF n’améliorait pas la synchronie et ne favorisait pas les oscillations gamma (Fig. supplémentaire. 6). Cependant, comme le h-ADF augmente la force synaptique entre les cellules e, son effet de synchronisation pourrait être simplement dû à l’augmentation du taux de pointe du réseau. Pour augmenter le taux de pointe sans affecter la force synaptique, nous avons décidé de fixer la force inter-e-cell à 2,5 mS et d’augmenter la fréquence du disque externe des cellules e de 6 à 20 Hz. Nous avons tracé le coefficient de synchronisation en fonction du taux de pointe du réseau. Même si la synchronie s’est avérée linéairement corrélée au taux de pic, h-ADF a augmenté le coefficient de synchronisation pour un taux de pic donné dans la plage de 4-14 Hz (Fig. supplémentaire. 6). Ceci a montré que pour un faible taux de pointe, le h-ADF augmente la synchronie indépendamment de l’activité moyenne du réseau. En conclusion, dans notre modèle, h-ADF augmente la synchronisation du réseau et favorise les oscillations en reliant la force synaptique interpyramidale à l’activité des interneurones.