La basilique a été fondée par l’empereur romain Constantin Ier sur le lieu de sépulture de Saint Paul, où il a été dit que, après l’exécution de l’Apôtre, ses disciples ont érigé un mémorial, appelé a cella memoriae. Cette première basilique a été consacrée par le pape Sylvestre en 324.
En 386, l’empereur Théodose Ier commença à ériger une basilique beaucoup plus grande et plus belle avec une nef et quatre nefs avec un transept. Elle a probablement été consacrée vers 402 par le Pape Innocent Ier. Le travail, y compris les mosaïques, n’a pas été achevé avant le pontificat de Léon Ier (440-461). Au 5ème siècle, elle était plus grande que l’ancienne basilique Saint-Pierre. Le poète chrétien Prudentius, qui l’a vu à l’époque de l’empereur Honorius (395-423), décrit les splendeurs du monument en quelques lignes expressives.
Sous Léon Ier, d’importants travaux de réparation ont été effectués à la suite de l’effondrement du toit à cause d’un incendie ou de la foudre. En particulier, le transept (c’est-à-dire la zone autour de la tombe de Paul) a été surélevé et un nouvel autel principal et un presbytère ont été installés. C’était probablement la première fois qu’un autel était placé au-dessus du tombeau de Saint Paul, qui restait intact, mais en grande partie souterrain étant donné les niveaux nouvellement élevés du sol de Leo. Léon était également responsable de la réparation de l’arc de triomphe et de la restauration d’une fontaine dans la cour (atrium).
Sous le pape saint Grégoire le Grand (590-604), le maître-autel et le presbytère ont été profondément modifiés. Le pavement du transept a été surélevé et un nouvel autel a été placé au-dessus de l’autel antérieur érigé par Léon Ier. La position était directement au-dessus du sarcophage de saint Paul.
À cette époque, il y avait deux monastères près de la basilique : celui de Saint Aristote pour les hommes et celui de Saint Stefano pour les femmes. Les messes étaient célébrées par un corps spécial de clercs institué par le pape Simplicius. Au fil du temps, les monastères et le clergé de la basilique déclinèrent; le pape Saint Grégoire II restaura l’ancien et confia aux moines les soins de la basilique.
Alors qu’elle se trouvait à l’extérieur des murs d’Aurélien, la basilique a été endommagée au 9ème siècle lors d’un raid sarrasin. Par conséquent, le pape Jean VIII (872-82) fortifia la basilique, le monastère et les habitations de la paysannerie, formant la ville de Johannispolis (en italien: Giovannipoli) qui exista jusqu’en 1348, date à laquelle un tremblement de terre la détruisit totalement.
En 937, lorsque Saint Odon de Cluny vint à Rome, Albéric II de Spolète, patricien de Rome, confia le monastère et la basilique à sa congrégation et Odo plaça Balduino de Monte Cassino en charge. Le pape Grégoire VII était abbé du monastère et en son temps Pantaleone, un riche marchand d’Amalfi qui vivait à Constantinople, a présenté les portes en bronze de la basilique maior, qui ont été exécutées par des artistes constantinopolitains; les portes sont inscrites avec la prière de Pantaleone pour que les « portes de la vie » lui soient ouvertes. Le pape Martin V le confia aux moines de la Congrégation de Monte Cassino. Il a ensuite été fait une abbaye nullius. La juridiction de l’abbé s’étendait sur les districts de Civitella San Paolo, Leprignano et Nazzano, qui formaient tous des paroisses.
Le cloître gracieux du monastère a été érigé entre 1220 et 1241.
De 1215 à 1964, elle fut le siège du patriarche latin d’Alexandrie.
Le 15 juillet 1823, un ouvrier réparant le plomb de la toiture déclencha un incendie qui entraîna la destruction quasi totale de cette basilique qui, seule parmi toutes les églises de Rome, avait conservé une grande partie de son caractère originel pendant 1435 ans.
En 1825, Léon XII publie l’encyclique Ad plurimas encourageant les dons pour la reconstruction. Quelques mois plus tard, il ordonna que la basilique soit reconstruite exactement comme elle l’avait été lorsqu’elle était neuve au fourth siècle, bien qu’il stipulât également que des éléments précieux des périodes ultérieures, tels que les mosaïques médiévales et le tabernacle, soient également réparés et conservés. Ces directives se sont révélées irréalistes pour diverses raisons et ont rapidement cessé d’être appliquées. Le résultat est une basilique reconstruite qui ne présente qu’une ressemblance générale avec l’original, et qui ne lui est en aucun cas identique. La reconstruction a d’abord été confiée à l’architecte Pasquale Belli, auquel a succédé à sa mort en 1833 Luigi Poletti, qui a supervisé le projet jusqu’à sa mort en 1869 et a été responsable de la part du lion des travaux. De nombreux éléments qui avaient survécu à l’incendie ont été réutilisés dans la reconstruction. De nombreux dirigeants étrangers ont également apporté des contributions. Muhammad Ali Pacha, vice-roi d’Égypte, a donné des colonnes d’albâtre, tandis que l’empereur de Russie a fait don de la malachite et du lapis-lazuli précieux qui ont été utilisés sur certains des fronts d’autel. Le transept et le maître-autel ont été consacrés en 1840 et cette partie de la basilique a ensuite été rouverte. L’ensemble du bâtiment a été reconstruit en 1854 en présence du pape Pie IX et de cinquante cardinaux. De nombreuses caractéristiques du bâtiment devaient encore être exécutées à cette date, cependant, et les travaux se sont finalement étendus au XXe siècle. Le quadriporticus regardant vers le Tibre a été achevé par le gouvernement italien, qui a déclaré l’église monument national. Le 23 avril 1891, une explosion au magasin de poudre à Forte Portuense détruit les vitraux de la basilique.
Le 31 mai 2005, le pape Benoît XVI a ordonné que la basilique passe sous le contrôle d’un archiprêtre et il a nommé l’archevêque Andrea Cordero Lanza di Montezemolo comme premier archiprêtre.