Gasteyer a développé une expérience de comédie avec le groupe de comédie à sketches improvisés de Los Angeles The Groundlings. Elle a joué de petits rôles sur Seinfeld (en tant que cliente condamnée de La Soupe nazie), ainsi que sur les émissions Party of Five, Frasier, Hope &Gloria et NYPD Blue. En 1996, Gasteyer rejoint le casting de Saturday Night Live. Parmi ses personnages les plus populaires figurent le professeur de musique du lycée Bobbie Mohan-Culp, l’animatrice de Delicious Dish de la Radio publique nationale Margaret Jo McCullen, la chanteuse féministe Lilith Fair Cinder Calhoun et ses impressions sur Martha Stewart et Céline Dion. En 2000, elle et Chris Parnell auditionnent pour succéder à Colin Quinn en tant que co-présentateurs du segment parodique Week-end Update, mais les postes reviennent finalement à Tina Fey et Jimmy Fallon.
Après six saisons, Gasteyer quitte SNL en 2002. Par la suite, elle est apparue dans divers programmes télévisés, films et productions scéniques. En 2004, Gasteyer a joué la mère du personnage principal Cady Heron (Lindsay Lohan) dans le long métrage Mean Girls, écrit par la partenaire de SNL Tina Fey. Le film a également présenté d’autres anciens membres de la distribution de SNL, dont Fey, Tim Meadows et Amy Poehler. Elle est également apparue dans le film musical Reefer Madness de Showtime en 2005 dans le rôle de Mae, la petite amie condamnée de Jack et propriétaire de the Reefer Den.
Gasteyer a joué dans une reprise de l’Opéra Threepenny à Broadway dans le rôle de Mme Peachum, aux côtés de Jim Dale, Alan Cumming et Cyndi Lauper. La production s’est déroulée du 24 mars au 25 juin 2006.
Le 24 juin 2005, Gasteyer a créé le rôle d’Elphaba dans la production sit-down de Chicago de la comédie musicale Wicked, aux côtés de Kate Reinders dans le rôle de Glinda. La production a débuté le 13 juillet 2005. Gasteyer a été nominée pour un Jefferson Award pour sa performance. Elle a joué sa dernière performance le 22 janvier 2006, remplacée par sa remplaçante Kristy Cates. Elle a ensuite repris le rôle dans la production de Broadway du 10 octobre 2006 au 7 janvier 2007, en remplacement d’Eden Espinosa.
Le 12 avril 2007, les médias ont annoncé que Gasteyer avait rejoint la distribution de la nouvelle comédie musicale, Writing Arthur, pour le Festival New Works for TheatreWorks 2007 en Californie, qui s’est déroulé du 14 au 22 avril. Gasteyer a joué à Chicago dans la Passion musicale de Stephen Sondheim au Chicago Shakespeare Theater du 2 octobre 2007 au 11 novembre 2007.
Elle a été initialement choisie pour jouer le rôle de Gloria dans the Encores! Production de la série estivale de Damn Yankees, mais en raison d’une blessure pendant les répétitions, elle a été remplacée par Megan Lawrence. Gasteyer a participé à la lecture de la version musicale de Broadway du First Wives Club.
Elle a joué le rôle de Kitty Dean dans la pièce de Broadway, The Royal Family qui a commencé ses représentations au Samuel J. Friedman Theatre le 15 septembre 2009 et a officiellement ouvert ses portes le 8 octobre 2009. Le spectacle a pris fin le 13 décembre 2009. Gasteyer a également joué le rôle de Frisco Kate Fothergill dans les centres-villes Encore! production de Girl Crazy, du 19 au 22 novembre 2009.
Elle revient à Saturday Night Live pour un épisode spécial de la Fête des Mères le 8 mai 2010, et pour un autre épisode de la Fête des Mères le 11 mai 2012.
Gasteyer est apparu dans la huitième saison de Curb Your Enthusiasm en tant que petite amie de Larry David.
De 2011 à 2014, Gasteyer a co-joué le rôle de Sheila Shay dans la série comique Suburgatory d’ABC, et à partir de mars 2013, elle était porte-parole du plan de régime Weight Watchers.
En 2014, profitant de sa formation de chanteuse, Gasteyer enregistre et sort I’m Hip, un album de standards de jazz. « One Mint Julep » était l’une des sélections qu’il comprenait. En 2015, elle joue Mimi Schwinn dans le New York City Center Encore! Reprise off-Broadway de la comédie musicale A New Brain, apparaissant également sur l’enregistrement de la distribution.
De 2016 à 2017, Gasteyer a joué un rôle principal dans le succès culte de TBS People of Earth, en tant que leader d’un groupe de soutien aux personnes enlevées par des extraterrestres.
En octobre 2019, elle sort l’album des fêtes Sugar&Booze. Gasteyer est apparu plus tard en tant que candidat à la deuxième saison du chanteur masqué sous le couvert de « The Tree », terminant finalement la compétition à la sixième place.
En février 2020, Gasteyer jouera le rôle de Katherine Hastings dans la comédie de NBC pilot American Auto écrite par Justin Spitzer. En septembre et octobre 2020, elle a exprimé un panda rouge nommé Nut dans une série animée pour adultes intitulée Magical Girl Friendship Squad.