Con el fin de aprovechar el poder de las endonucleasas dirigidas, el laboratorio Jerome trabajó para optimizar un sistema de administración útil tanto para estudios in vivo como in vitro. Utilizaron un sistema de administración de virus adeno-asociados (AAV) para atacar los ganglios trigéminos de ratón con cualquiera de las dos endonucleasas específicas del VHS: HSV1m5, que está diseñado para escindir el gen de la proteína de virión VP5, y HS1m8 ,que se dirige al gen que codifica la subunidad catalítica de la polimerasa de ADN. La creación de mutaciones en cualquiera de estos genes causa la interrupción del genoma viral e impide la producción de viriones. Para aumentar aún más los efectos del tratamiento Trex-2, se co-transdució una endonucleasa de 3′-5′, que ha demostrado aumentar la mutagénesis dirigida. Después de establecer el sistema, el laboratorio comenzó un trabajo in vitro centrado en las neuronas, el tipo de célula biológicamente relevante. Cultivos de neuronas fueron co-transducidos con HSV1m5 o 8 y Trex-2 y luego infectados con HSV. Los cultivos tratados mostraron una reducción del 50% en el título viral, así como la presencia de mutaciones en el VHS por el ensayo de endonucleasa 1 T7 y la secuenciación clonal. Una vez que se estableció la interrupción de la infección lítica, los investigadores comenzaron a analizar los efectos en las diferentes etapas de la infección por el VHS. Utilizando cultivos infectados de neuronas con VHS y tratados posteriormente con VHS 1m5 u 8 con Trex-2 en diferentes momentos, los investigadores pudieron simular las diversas etapas de la infección. Trataron cultivos a los 7 días (fase aguda), 14 días (fase aguda tardía/ fase latente temprana) y 32 días (fase latente) y no encontraron cambios en el efecto independientemente de la fase viral. Esto sugiere que el VHS es igualmente susceptible a la mutagénesis de endonucleasas independientemente de la fase viral. Los niveles de mutaciones en el sitio diana oscilaron entre 4,5-7,6% y 1,1-6,6% para HSV1m5 y HSV1m8, respectivamente. Actualmente, este es el primer estudio que analiza la actividad de la endonucleasa en neuronas latentemente infectadas.
Alentados por los resultados in vitro, los investigadores realizaron estudios in vivo utilizando ratones infectados con VHS seguidos 32 días después de una inyección de AAV (expresando VHS 1m5 u 8 y Trex-2). Las neuronas de los ratones se muestrearon 30 días después de la inyección de AAV para detectar el título viral, la carga viral y las mutaciones del genoma del VHS. El grupo mostró mutaciones del 1-2% en 2/4 ratones para HSV1m5 y en 3/4 ratones para HSV1m8. Sin embargo, la carga viral de estos animales fue similar entre los animales de control y los tratados. La diseminación viral se retrasó un día en los animales tratados, pero alcanzó niveles similares con el tiempo en comparación con los no tratados. Al reflexionar sobre los resultados, el Dr. Jerome dijo :» Esta es la primera vez que se establece una infección viral latente real en un animal, y luego se deshabilita, incluso parcialmente, usando terapia de endonucleasa. Por lo tanto, representa un paso crítico para llevar tales terapias a la aplicación humana. El principal desafío ahora es aumentar la potencia de la terapia, de modo que todo o casi todo el virus latente esté genéticamente desactivado. Estamos investigando nucleasas más nuevas y eficientes como CRISPR / Cas, y evaluando nuevos métodos de entrega de nucleasas a neuronas infectadas in vivo.»En el futuro, esta terapia puede llevar a una nueva forma de pensar sobre el tratamiento de enfermedades latentes como el VHS y el VIH que actualmente consideramos incurables.
El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud y la Fundación Canadiense.Aubert M, Madden EA, Loprieno M, DeSilva Feelixge HS, Stensland L,Huang ML, Greninger AL, Roychoudhury P, Niyonzima N, Nguyen T,Magaret A, Galleto R, Stone D, Jerome KR. 2016. Interrupción in vivo del VHS latente mediante terapia de endonucleasa de diseño. JCI Insight, 1(14).