1 Teoría
Los oligonucleótidos se sintetizan mediante la adición de una base a la vez, que se extiende desde el extremo 3′ hasta el extremo 5′, unido a un soporte de fase sólida. Cuando se completa la síntesis química del oligonucleótido, la cadena de ADN se libera del soporte sólido mediante incubación con hidróxido de amonio. El amonio también actúa como agente desprotector, separando los grupos que protegen los fosfatos en los enlaces fosfodiéster. Después de esto, se agrega amoníaco caliente para hidrolizar los grupos protectores de los grupos amino exocíclicos de desoxiadenosina, desoxicitosina y desoxiguanosina. El oligonucleótido podría suministrarse al usuario en la solución de amoníaco como preparación cruda. En este caso, antes de su uso, puede ser necesario realizar un paso adicional para eliminar las sales y los subproductos del preparado de oligonucleótidos generado durante la desprotección.
Después de la desprotección, la preparación de oligonucleótidos generalmente se desaliniza, cuantifica, se evapora a sequedad en un liofilizador y se suministra al usuario en forma de polvo. La solución de oligonucleótido desalada contiene el oligonucleótido de longitud completa, pero también contiene una mezcla de productos truncados que se acumularon durante la síntesis química. El truncamiento ocurre cuando la base especificada no se agrega a la cadena en el ciclo correspondiente (Hecker & Rill, 1998). Por lo tanto, el porcentaje de productos truncados acumulados en la preparación está determinado por la eficiencia de síntesis (la fracción de producto de longitud completa después de la síntesis) y la longitud de la molécula. Los oligonucleótidos largos, que requieren más ciclos para ser sintetizados, son menos puros que los oligonucleótidos cortos. Estas fallas pueden competir con el producto de longitud completa en algunas aplicaciones y es posible que sea necesario eliminarlas antes de que se pueda usar el oligonucleótido. Sin embargo, las preparaciones de oligonucleótidos desalados son generalmente adecuadas para muchas aplicaciones, como PCR estándar o microarrays, especialmente si el oligonucleótido tiene < 20 nucleótidos de longitud.
Se recomienda una mayor purificación de oligonucleótidos de más de 50 bases porque el porcentaje de producto de longitud completa en la preparación no suele ser superior al 80%. Para aplicaciones exigentes en las que la longitud exacta del oligonucleótido es importante, como los ensayos de cambio de gel, la mutagénesis dirigida al sitio, la secuenciación, la producción de adaptadores de clonación o la síntesis de ADNc de primera hebra para la generación de bibliotecas, se recomienda una purificación adicional, incluso para oligonucleótidos más cortos (ver más información sobre las técnicas anteriores en Ensayos Estándar in vitro para Interacciones de Proteínas y Ácidos Nucleicos: Ensayos de cambio de gel para la Unión de ARN y ADN y Mutagénesis Dirigida al sitio).
La purificación puede ser necesaria después de la síntesis o después de la modificación enzimática del oligonucleótido. Hay varios métodos para lograr esto, y la elección depende de la naturaleza del oligonucleótido y la aplicación a la que está destinado.
La purificación de HPLC de fase inversa se basa en la hidrofobicidad. Utiliza una fase estacionaria no polar, y tampones acuosos y disolventes orgánicos como fase móvil para eluir los analitos; los compuestos polares se eluyen primero, mientras que los compuestos no polares se retienen. Este es el mejor método para purificar oligonucleótidos modificados con un grupo hidrofóbico, como la biotina, las etiquetas de tinte fluorescente o las conjugaciones éster-NHS. La recuperación de masa es mayor que cuando se utiliza la purificación de PÁGINAS y es susceptible a la purificación de mayores cantidades de oligonucleótidos (escala mmol), aunque no elimina productos incompletos de manera tan efectiva. Los cartuchos de purificación de oligonucleótidos, basados en cromatografía de fase inversa, proporcionan un método rápido de desalación y purificación de oligonucleótidos.
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) resuelve los oligonucleótidos de acuerdo con su longitud y, por lo tanto, ofrece suficiente resolución para diferenciar los productos de longitud completa de las moléculas fallidas (Atkinson y Smith, 1984). Los geles de poliacrilamida son más eficaces para separar pequeños fragmentos de ADN que los geles de agarosa (véase Análisis de ARN mediante electroforesis analítica en gel de poliacrilamida y Electroforesis en gel de Agarosa). La única desventaja de los geles de poliacrilamida es que son más difíciles de preparar y manipular que los geles de agarosa. Los geles de poliacrilamida se ejecutan en una configuración vertical en un campo eléctrico constante. Después de la electroforesis, el oligonucleótido se eluta a partir del gel y se concentra, utilizando precipitación de etanol (encuentre más información sobre precipitación de ácidos nucleicos en métodos de purificación – precipitación de ARN) o cromatografía de fase inversa. Este es el método de elección cuando se desea el mayor porcentaje de oligonucleótidos de longitud completa para aplicaciones exigentes. También se recomienda encarecidamente para oligonucleótidos de más de 30 bases. Además, se pueden ejecutar varias muestras simultáneamente y no se requiere equipo costoso. El único inconveniente de esta técnica es la pequeña cantidad de oligonucleótido obtenida por purificación. Típicamente, los oligonucleótidos se usan a una escala de 1 µmol o menos, y la recuperación de masa después de la purificación de la página es < 50% e incluso menor en el caso de los oligonucleótidos modificados. Sin embargo, aunque el rendimiento es bajo, es satisfactorio para la mayoría de las aplicaciones bioquímicas.
El preparado de oligonucleótidos se carga en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en una cantidad de al menos 1 mg por carril. El rango de resolución del gel depende de la concentración de poliacrilamida. Para oligonucleótidos cortos (de 15 a 35 bases), se recomiendan geles de poliacrilamida del 13-15%; para oligonucleótidos más largos (de 35 a 70 bases), se recomiendan geles de poliacrilamida del 8-13%. El porcentaje del gel debe adaptarse al sistema de circulación. Por lo general, utilizamos el sistema Bio-Rad Mini Protean II y ejecutamos geles al 15% para purificar oligonucleótidos de 25 bases de longitud. Después de identificar la banda correcta mediante visualización UV, la banda se extirpa y se extrae del gel.
En este capítulo se describen dos métodos diferentes de purificación de oligonucleótidos a partir de geles de poliacrilamida. El método más sencillo es la elución por difusión. Esto se basa en el movimiento de moléculas de una región de mayor concentración a una de menor concentración. El resultado de la difusión es una mezcla gradual de material. Este método consume mucho tiempo, pero no requiere demasiada mano de obra ni ningún equipo. Básicamente, la banda de poliacrilamida que contiene el oligonucleótido de interés se corta en trozos pequeños y se cubre con tampón de elución. Después de la incubación, el ADN se purifica del sobrenadante por precipitación de etanol. El rendimiento es limitado, entre el 20% y el 70%, dependiendo de la longitud del oligonucleótido. Cuanto mayor sea la cantidad de tampón de elución utilizado, más oligonucleótido se difunde del gel.
El segundo método es la electroelución en una bolsa de diálisis (McDonell et al., 1977). La pieza de gel que contiene el oligonucleótido se extirpa y se coloca en una bolsa de diálisis con un tampón. La aplicación de una corriente eléctrica hace que el ADN emigre del gel al tampón de la bolsa de diálisis. El oligonucleótido se recupera de este tampón y se purifica. Con este método, el oligonucleótido se puede aislar con un buen rendimiento, aunque requiere mucho tiempo si se purifica un gran número de muestras al mismo tiempo, ya que requiere la inserción de cada banda de gel en bolsas de diálisis individuales. Este método también funciona bien para fragmentos de ADN más grandes e incluso se puede usar para extraer ADN de geles de agarosa.