Evaluación de los niveles de CI50 inmediatamente después del tratamiento con reactivos anticancerosos utilizando un dispositivo de monitorización celular en tiempo real

Introducción

Un sistema de análisis de monitorización celular en tiempo real (RTCA) fue desarrollado previamente para la monitorización continua de cultivos celulares adherentes (1). Este método no invasivo y sin etiquetas se basa en la medición de la impedancia eléctrica (índice celular, IC) entre regiones interdigitadas en la base de las placas de cultivo de tejidos. La medición del CI proporciona información cuantitativa sobre el estado biológico de las células adherentes. En realidad, el significado de CI es el número de células de supervivencia en la superficie de la placa E. Estos datos incluyen el número de células,la viabilidad y la morfología como un perfil en tiempo real (2-4). RTCAsystem es conocido por dispositivo de detección temprana de reacción celular como fenotipo adinámico contra algunos reactivos (5).

En nuestro estudio anterior, la citotoxicidad de imatinib en el carcinoma de células escamosas orales (OSCC) se evaluó utilizando el WST-8(5– 3-(2- ensayo de metoxi-4-nitrofenil)-2-(4-nitrofenil) – 2H – tetrazol – 3-i) como medición del punto final (6), y posteriormente con un sistema RTCA (7).Las mediciones de punto final por MTT (bromuro de 3 bromide 2,5-difeniltetrazolio) y los ensayos WST-8 se utilizan habitualmente para evaluar la citotoxicidad. Sin embargo, tales ensayos están limitados por variaciones en los efectos de diferentes agentes anticancerígenos en diferentes líneas celulares. Además, los valores de CI50 calculados mediante ensayos de valoración in vitro tienden a ser más altos que las concentraciones efectivas in vivo (8,9).

En nuestro estudio anterior, los valores CI50 medidos por el sistema RTCA fueron inferiores a los medidos por el ensayo WST-8, lo que sugiere que el sistema RTCA puede evaluar sensiblemente la citotoxicidad y la influencia del imatinib en la adherencia celular. Sin embargo, no está claro si la evaluación de los valores CI50 de otros agentes anticancerosos utilizando el sistema RTCAsystem sería útil, ya que existen diferencias en las reacciones citotóxicas entre los fármacos moleculares dirigidos, como el imatinib, y los agentes anticancerosos a lo largo del tiempo.

En este estudio, necesitamos seleccionar algún tipo de líneas celulares para determinar la diferencia del perfil de reacción celular frente a los reactivos anticancerígenos en tiempo real utilizando el sistema RTCA.Se seleccionaron líneas celulares SQUU-A no invasivas y líneas celulares SQUU-B invasivas establecidas a partir de tumores de cáncer de lengua recidivantes locales en un solo paciente, porque estábamos investigando metástasis de líneas celulares SQUU-B utilizando líneas celulares SQUU-A y líneas SQUU-Bcell (10-12). La línea celular SAS se estableció a partir de carcinoma de células escamosas humanas de lengua muy diferenciadas(13). Se estableció una línea celular NA como una línea celular productora de fibronectina (14). Además, se ha informado de que la citotoxicidad de los reactivos anticancerígenos en OSCC se ha evaluado en la línea celular SQUU-A y la línea celular SQUU-B (15), la línea celular SAS (16) y la línea celular NA (17) utilizando varios métodos convencionales.Por eso, en el presente estudio seleccionamos cuatro de estas líneas celulares con cada característica característica, que también se utilizaron en el ensayo citotóxico del estudio anterior.

En este estudio, nos centramos en un nuevo dispositivo RTCA desarrollado para la medición en tiempo real y evaluamos los valores CI50 como una escala para evaluar la citotoxicidad de nuestros agentes anticancerígenos en cuatro líneas celulares OSCC. Esto nos permitió obtener información sobre las variaciones observadas entre los diferentes reactivos anticancerígenos y las líneas celulares en tiempo real.

El objetivo del presente estudio fue obtener 50 perfiles a partir de la adición inmediata de agentes anticancerosos utilizando un sistema RTCA. Este estudio demostró la ventaja de evaluar la citotoxicidad de los agentes anticancerígenos utilizando un sistema RTCA en comparación con un ensayo de punto final.

Materiales y métodos

Reactivos y materiales

El 5-Fluorouracilo (5-FU) se diluyó a indimetilsulfóxido de 100 mM (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA).La doxifluridina y el carboplatino se diluyeron a 100 y 50 mm,respectivamente, en agua destilada. El docetaxel se diluyó a 10 mm de inetanol. Todos los reactivos anticancerosos se obtuvieron de Wako PureChemical Industries, Ltd., (Osaka, Japón) y almacenado a -20°C.

Cultivo celular

Líneas celulares OSCC humanas SQUU-A, SQUU-B, SAS y NAwere derivadas de muestras de lengua humana. El SQUU-A y el SQUU-B, proporcionados por Morifuji-Wilson M (Universidad de Kumamoto,Kumamoto, Japón), se establecieron a partir de tumores de cáncer de lengua recidivantes locales (18). SAS (13,19,20) fue adquirido del Banco de Células Riken BRC (Tsukuba, Japón). NA (14) fue amablemente proporcionada por el Dr. Jun -chi Iwata (Universidad de Kyushu; Fukuoka, Japón). Todas las líneas celulares se mantuvieron en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japón) que contiene un 10% de suero fetal de ternera (Biowest, Nuaille, Francia) a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

La medición de la proliferación de células OSCC mediante el ensayo de citotoxicidad RTCA

El iCELLigence system (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) como el sistema RTCA. Todo el control se realizó a 37°C con contenido de CO2 regulado (5%). Las placas E (placas de cultivo para el sistema iCELLigence)que contenían 200 µl de medio de cultivo por pocillo se equilibraron a 37°C, y el CI se estableció en cero en estas condiciones. Se añadieron células(2×104 células/pocillo a menos que se especifique lo contrario) en un medio de cultivo de 560 µl Se añadieron agentes anticancerígenos a las 24 h después de la siembra de las células. El IC fue monitorizado en tiempo real durante 96 h después de la siembra de células. Los valores de IC50 se calcularon mediante el software de análisis RTCAData versión 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

Se estableció una concentración de ocho puntos de cuatro agentes anticancerígenos en base a los valores de Cmax en el estudio anterior(21-25). Además, se establecieron puntos de tiempo durante 72 h, incluidas 24 h y 48 h, que fueron el método general para evaluar la citotoxicidad en el ensayo de punto final.

Ajuste de curva de los datos de IC50

Utilizamos la siguiente fórmula de respuesta a la dosis sigmoidal para calcular los valores de IC50: Y=IC bajo + (IC alto-IC bajo) / {1+10 ^ (Log IC50-X)}, donde ‘IC bajo ‘representa los valores mínimos de IC,’ IC alto ‘ representa los valores máximos del índice de células, Y es el índice de células y X es el registro de concentración (M).

Medición de la proliferación de células OSCC mediante el ensayo WST-8

Después de la siembra inicial y el cultivo de células OSCC,el medio de cultivo se eliminó y se reemplazó por medio que contenía anticanceragentes. Después de 24, 48 y 72 h de incubación, se añadió tinte WST-8 de 20 µl (Kit de Conteo de células-8; Dojindo Corporation,Tokio, Japón) a cada pozo. Después de 3 h, las placas se leyeron a 450 nm / 655 nm. La tasa de supervivencia celular se calculó utilizando la fórmula siguiente (7). Los valores ci50 se calcularon por regresión de aproximación lineal de la supervivencia del porcentaje versus la concentración del fármaco.

Tasa de supervivencia celular (%)=(a-c)/(b-c) ×100 (a=absorbancia a cada concentración del reactivo anticanceroso,b=absorbancia a 0 µM del reactivo anticanceroso y c = absorbancia del espacio en blanco).

Análisis estadístico

Todos los datos se muestran como la media ± desviación estándar(DE) de tres experimentos independientes. Las correlaciones entre los valores de IC50 obtenidos mediante el sistema RTCA y el ensayo WST-8 fueron evaluadas para su significación estadística por el Spearmantest. Los valores de dos colas de P< 0,05 se consideraron asignantes.

Resultados

Efecto de la concentración de agentes anticancerígenos sobre la proliferación celular de OSCC utilizando el sistema RTCA

Evaluamos la citotoxicidad de cuatro agentes anticancerígenos (5-FU, doxifluridina, carboplatino y docetaxel) en líneas celulares de fourOSCC monitorizando los valores de IC durante 96 h después de que las células se sembraron a 2×104 células / pocillo en placas E(Figs. 1–4). Los valores de IC disminuyeron de forma dependiente de dosis en las cuatro líneas celulares OSCC. Por lo tanto, la reducción de los valores de IC se correlacionó con la disminución de las células number.As se muestra en la Fig. 2, el valor de IC para la línea de células SQUU-B invasiva fue menor que los de otros CECC cells.As se muestra en la Fig. 3, El perfil de IC obtenido para la línea celular SAS mostró un aumento retardado después de 48 h. Mostrado en la Fig. 4, la tasa de proliferación y el valor máximo de CI en la línea celular NA fueron superiores a una de las otras líneas celulares.

Medición en tiempo real de los perfiles CI50 de agentes anticancerígenos en células OSCC utilizando el sistema RTCA

Los perfiles CI50 de los cuatro agentes anticancerígenos en las cuatro líneas celulares OSCC fueron determinados por el sistema RTCA y calculados por el software comercial provisto con el instrumento (un subconjunto de los datos de SQUU-B se muestran en la Fig. 5). Se trazaron los valores de CI50 durante 72 horas después de la adición de agentes anticancerígenos. Los valores de CI50 a las 24, 48 y 72 h para las cuatro líneas de células se resumen en las Tablas I a IV, como se muestra en la Fig. 5, hubo desfase de tiempo en las reacciones citotóxicas del 5-FU (Fig. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Mientras tanto, las curvas de viabilidad celular de Cu-B usando el ensayo WST-8 también se mostraron en materiales suplementarios (Figs. S5 a S8). Los valores de R2 a las 72 h después de la adición de reactivos anticancerígenos en el ensayo WST-8 fueron bajos en reactivos de fouranticáncer en comparación con uno de 24 h y 48 h. Estos resultados mostraron que es deseable que el ensayo de punto final se realice a las 24 h o 48 h para ser utilizado como protocolo general. En este estudio, las curvas de viabilidad celular del ensayo WST-8 se mostraron en materiales complementarios porque no había novedad en el cálculo de los valores de CI50 utilizando el ensayo WST-8.

Correlaciones entre mediciones en tiempo real de los valores de CI50 utilizando el sistema RTCA y mediciones de puntos finales de los valores de CI50 utilizando el ensayo WST-8 en celdas OSCC

Como se muestra en la Fig. 6, valores de CI50 a 24, 48 y 72 h usando dos métodos fueron trazados. El eje horizontal muestra valores IC50 en tiempo real medidos mediante el sistema RTCA, mientras que el eje longitudinal muestra valores IC50 de punto de retorno medidos mediante el ensayo WST-8. Se observó una correlación positiva entre los dos tipos de método de ensayo para medir la CI50 de cada agente anticanceroso.Los resultados de 5-FU, doxifluridine, carboplatino y docetaxcelwere y=8.19 x+346.02 (R2=0.94,rs=0.66, *P<0.05), y=1.00 x+172.70(R2=0.91, rs=0.82, **P<0.01),y=1,90 x+206.81 (R2=0.92,rs=0.96, **P<0.01), andy=13.53 x+0.08 (R2=0.95,rs=0.73, *P<0.05), respectivamente. Los valores de CI50 en tiempo real tendían a ser inferiores a los valores de punto final IC50 correspondientes.

Discusión

Los valores de IC calculados por la RTCA también representan el estado de la celda (3). Culos de Higos. 1-5, los valores de SD de los valores de IC fueron demasiado pequeños para ver. Por ejemplo, todos los valores SD de la Fig.1 estaban por debajo de 0,05. La razón de los bajos valores de IC de SQUU-B sugirió que la proteína de adhesión E-cadherina desempeña un papel esencial en la metástasis, con niveles reducidos de E-cadherina que promueven la migración de células y la invasión celular (26). La razón de los altos valores de CI máximo de ANA se sugirió que se ha informado de que la proliferación y adhesión celular acelerada por fibronectina debido a la característica de la línea celular de ANA como línea celular productora de fibronectina (6). Por lo tanto, las reacciones celulares de cada línea celular frente a cuatro reactivos anticancerígenos fueron variables. En este estudio no pudimos encontrar la relación causal entre los valores de CI50 y la característica de las líneas celulares. Sin embargo, es importante detectar una reacción celular en tiempo real como perfil de IC para evaluar la citotoxicidad del reactivo anticanceroso al considerar la aplicación farmacéutica en humanos.

El perfil CI50 de la línea celular SQUU-B se describe en la Fig. 5 como un perfil IC50 representativo porque no hubo diferencias en el patrón de perfil IC50 en la misma línea celular en caso del mismo reactivo, aunque calculamos los valores de IC50 en toda la línea celular utilizando cuatro reactivos anticancerígenos. Encontramos que los perfiles de CI50 variaban para cada agente anticancerígeno y para cada línea celular OSCC. Como se muestra en la Fig.El 5, el 5-FU y el docetaxel requirieron más de 24 h (48 h en la figura) para comenzar a ejercer un efecto citotóxico en las células OSCC,mientras que los valores de CI50 se recuperaron de aproximadamente 24 h(48 h en la figura) después de la adición de doxifluridina y carboplatino. Por lo tanto, sugerimos que las diferencias de los perfiles en tiempo realIC50 fueron causadas por reactivo anticanceroso. Estas observaciones no habrían sido posibles sin la medición en tiempo real utilizando la RTCA. El monitoreo en tiempo real de los valores del CI50 también reveló que estos valores cambiaron notablemente con el tiempo. Existe la posibilidad de no detectar cambios utilizando métodos convencionales, ya que solo se evalúa un punto de tiempo de la CI50 después del tratamiento con el agente anticancerígeno mediante un ensayo de punto final.

El sistema RTCA es diferente de los ensayos de punto final tradicionales porque la medición de impedancia no es invasiva y puede proporcionar datos cuantitativos de alta calidad sobre citotoxicidad de manera continua. Como se muestra en la Fig.6, hubo correlaciones positivas significativas entre los valores CI50 obtenidos con el sistema RTCA y el ensayo WST-8, a pesar de que hubo algunas diferencias en los valores absolutos de IC, como los valores bajos de IC obtenidos para la línea de células SQUU-B. Estos resultados sugirieron que incluso un CI bajo obtenido para algunas líneas celulares podría evaluar la alta sensibilidad a la citotoxicidad en el sistema RTCA. Mientras que, los valores de IC50 en tiempo real fueron inferiores a los valores de IC50 de punto final cuando se compararon los valores de IC50 en tiempo real obtenidos con el sistema RTCA con los valores de IC50 de punto final obtenidos con el ensayo WST-8.Estos resultados sugieren que el sistema RTCA se puede utilizar para evaluar de forma sensible el efecto de los agentes anticancerígenos en la proliferación y adhesión celular.

En el sistema RTCA, la célula adherente actúa como un aislante en la superficie del electrodo y cambia el medio iónico de la solución del electrodo, aumentando la impedancia (27). Por lo tanto, el CI es función del número de células y la proporción de células en diferentes intervalos de tiempo. IC = 0 cuando no hay adhesión celular (5). Los cambios descritos por el sistema RTCA se reflejan en el fenotipo dinámico de célula. Esta monitorización dinámica de la interacción célula-fármaco permite obtener una mejor comprensión de los efectos temporales del invitro, especialmente inmediatamente después del tratamiento con fármaco(28). La característica cinética de las células ofrece información perspicaz que no se puede adquirir de un ensayo convencional de punto final único, como el ensayo WST-8. Mientras, los resultados del ensayo WST-8 reflejan la reacción metabólica de survivalcell (29). La toxicidad mediante el ensayo WST-8 podría subestimarse si se mantuviera la reacción metabólica celular a pesar de que se produjera una reacción celular dinámica. Sugerimos que estas diferencias de principio en dos métodos fueron inducidas por diferencias mayores de valor CI50 de hasta 8 veces entre dos métodos, como se muestra en la Fig. 6A. Nuestro estudio anterior informó que la CI50 de imatinib en células ESCU calculadas por el sistema RTCA y el ensayo WST-8 fueron de 4 µM y 60 µm, respectivamente (sensibilidad de 15 veces) (6,7). Otros grupos de investigación informaron que la CI50 de cisplatino en células HK-2 calculada por el sistema RTCA y el ensayo WST-8 fue de 0,76 µM y 25 µm, respectivamente (sensibilidad de 33 veces) (30,31).Estos datos anteriores respaldaban nuestros datos para demostrar su validez.

Es importante obtener mediciones inmediatamente después del tratamiento con agentes anticancerosos para evaluar tanto los efectos secundarios de los agentes como sus efectos deseados. Sin embargo, hay pocos informes de métodos útiles que correlacionen los datos de invitro con los datos humanos in vivo. Consideramos que la medición en tiempo real utilizando el sistema RTCA beneficiaría la evaluación de los efectos secundarios de los agentes anticancerígenos en células normales.

Los valores de Cmax previamente notificados de 5-FU,doxifluridina, carboplatino y docetaxel son 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), y 2 µM (24,25),respectivamente, cuando se utilizan para tratamiento intravenoso en humanos. Nuestros datos se correlacionaron con los datos en humanos porque los valores Cmax se incluyeron en el rango de las dosis experimentales utilizadas en este estudio.

Los sistemas RTCA son el nuevo dispositivo principal para evaluar la citotoxicidad, que emplean la intensidad de impedancia de la cohesión celular y no la actividad enzimática en las células diana, como el ensayo MTT. Los valores de CI50 de los agentes anticancerosos calculados por el sistema RTCA se correlacionaron significativamente con los niveles de CI50 calculados por el ensayo de valoración convencional. Además, el sistema RTCA obtuvo mediciones automáticamente en tiempo real inmediatamente después del tratamiento con agentes anticancerígenos.

En realidad, el sistema RTCA no puede evaluar directamente la citotoxicidad del hormigón,como la muerte celular o la apoptosis, etc., porque el índice celular se calculó en función de la impedancia. Por este motivo, el ensayo combinado entre el sistema RTCA y la medición de la muerte celular podría ser un método eficaz en caso de evaluación de la reacción celular del hormigón, como la muerte celular o la apoptosis con precisión.Por ejemplo, el ensayo de tinción de anexina V o expresión de caspasa-3para la detección de apoptosis, el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) para la detección de muerte celular podría ser un método eficaz(32,33). Además, podría ser útil evaluar la expresión de proteína inflamatoria en las células normales para detectar el efecto secundario cuando se añadió reactivo anticanceroso a las células normales sembradas en la placa electrónica. El monitoreo dinámico en tiempo real durante el cultivo de células, incluidos los reactivos anticancerígenos, puede proporcionar información valiosa para la detección temprana de la eficiencia terapéutica y el efecto secundario, que no se puede evaluar en métodos convencionales en el ensayo de punto final. Por lo tanto, el valor IC50 calculado por el sistema RTCA podría ser un parámetro útil para, por ejemplo, el cribado desde el punto de vista de la medición en tiempo real en forma automatizada, evitando problemas colorimétricos o contaminación. Además, el sistema RTCA permite el análisis de todo el período del experimento y no requiere el etiquetado que puede afectar negativamente a los experimentos de cultivo celular.

La novedad de este estudio es que el sistema RTCA puede detectar una alta sensibilidad a la citotoxicidad en comparación con un método convencional, el ensayo WST-8. Además, el sistema RTCA podría evaluar preciosamente el valor CI50 en tiempo real sin restricción de período experimental durante al menos 72 horas después de la adición de reactivos anticancerosos.

En conclusión, nuestros resultados demostraron que los sistemas RTCAsystems son útiles para evaluar la citotoxicidad y podrían utilizarse en el desarrollo futuro de agentes quimioterapéuticos utilizando células cancerosas y la evaluación de sus efectos secundarios en células normales. Además, se puede utilizar un sistema RTCA para evaluar los perfiles de reacción celular,como la terapia combinada y las interacciones célula-anticuerpo o fármaco-fármaco, de los reactivos anticancerosos.

Material Complementario

Datos de Apoyo

Agradecimientos

No aplicable.

Financiación

No se recibió financiación.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles en el autor correspondiente de reasonablerequest.

Contribuciones de los autores

MH y MN concibieron y diseñaron el estudio. MH andTN realizó los experimentos y adquirió los datos. MH analizó los datos, preparó las figuras y redactó el manuscrito. MH, TKY y MN interpretaron los resultados. MH y TKY editaron y revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Aprobación y consentimiento ético para participar