Identification of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa in Blood Cultures: una Evaluación Multicéntrica del Rendimiento de un Ensayo de Hibridación Fluorescente In Situ de Ácido Nucleico de Péptidos de Tres Colores

TEXTO

Los bacilos Gram negativos (GNB) se relacionan con infecciones del torrente sanguíneo (BSI) que producen una mortalidad significativa, en particular en pacientes en unidades de cuidados intensivos (UCI). Entre los patógenos GNB más prevalentes se encuentran Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa (4, 8). La selección de la terapia empírica para las infecciones por GNB es un desafío debido a la resistencia antimicrobiana inherente entre muchas P. cepas de aeruginosa y resistencia emergente a agentes antimicrobianos de carbapenem entre aislados de K. pneumoniae. La rápida identificación de patógenos en el mismo día directamente de botellas de hemocultivos recién positivas puede afectar la selección adecuada de terapia empírica, un factor importante para mejorar los resultados de los pacientes (7). Ensayos de hibridación fluorescente in situ de ácido nucleico péptido (PNA FISH) (AdvanDx Inc. se ha demostrado que se comparan favorablemente con los métodos de identificación fenotípica automatizados y pueden producir resultados en aproximadamente 90 min (10). Una limitación de los ensayos actuales de GNB PNA en PECES aprobados por la FDA (E. coli / P. aeruginosa PECES con ANP y E. coli, K. pneumoniae /P. aeruginosa PECES con ANP) es la incapacidad de diferenciar E. coli de K. pneumoniae. En este estudio multicéntrico se evaluó el rendimiento de los semáforos GNR (barras gramnegativas) con PNA FISH (no aprobados por la FDA en el momento de este estudio), el primer ensayo rápido con PNA FISH para identificar 3 GNB principales (E. coli, K. pneumoniae y P. aeruginosa) directamente a partir de hemocultivos recién positivos.

Cuatro sitios de estudio de los Estados Unidos recolectaron hemocultivos clínicos con GNB positivo. El método de identificación fenotípica para cada laboratorio se realizó utilizando MicroScan (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) o VITEK2 (bioMérieux, Inc., Durham, NC). Los datos recopilados para este estudio no tenían identificadores de pacientes, y solo se utilizaron hemocultivos extraídos con fines clínicos. Se obtuvo la aprobación o exención de la Junta de Revisión Institucional (IRB) para el protocolo del estudio de cada institución. Cada sitio utilizó uno de los siguientes tres sistemas de hemocultivos automatizados de monitoreo continuo: BacT / Alert (bioMérieux, Inc., Durham, NC), BACTEC (Diagnóstico BD, Spark, MD) o VersaTREK (Sistemas de Diagnóstico Trek, Cleveland, OH). Para cada muestra, se realizó un semáforo GNR PNA FISH, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se examinaron con microscopía de fluorescencia(objetivo de aceite de 60× o 100×, isotiocianato de fluoresceína de paso de doble banda / filtro rojo Texas). Los resultados se interpretaron como positivos cuando se observaron células fluorescentes en múltiples campos de visión, de la siguiente manera: verde para E. coli, rojo para P. aeruginosa y amarillo para K. pneumoniae. Además, EK/P. aeruginosa PNA FISH se realizó en cada muestra (datos no mostrados). El PNA FISH del semáforo GNR se realizó simultáneamente con la identificación de laboratorio de rutina en el exceso de material de hemocultivo. El operador de la prueba de PECES con ANP en cada sitio de estudio no pudo ver los resultados de la identificación de laboratorio de rutina hasta que se completaron todas las pruebas.

Se incluyeron en el estudio un total de 490 hemocultivos clínicos positivos para GNB por tinción de Gram y 4 frascos de hemocultivos enriquecidos con aislados clínicos de P. aeruginosa. Los métodos automatizados de identificación fenotípica identificaron 537 aislados, incluidos 43 en cultivos de crecimiento mixto de 2 o más organismos. De los organismos identificados, 186 (34,6%) eran E. coli, 110 (20,5%) eran K. pneumoniae y 48 (8,9%) eran P. aeruginosa. De los 43 cultivos mixtos, se identificó que 15 tenían 2 de los organismos objetivo de PECES del semáforo GNR PNA presentes y, por lo tanto, se esperaba que mostraran 2 resultados de fluorescencia. Los peces de PNA del semáforo GNR identificaron correctamente el 100% (186/186) de los aislados de E. coli, el 99,1% (109/110) de los aislados de K. pneumoniae y el 95,8% (46/48) del P. aislados de aeruginosa (Tabla 1). Se registró un falso negativo para K. pneumoniae y dos falsos negativos para P. aeruginosa, todos en cultivos mixtos (no se disponía de aislados para repetir la prueba). De acuerdo con el etiquetado del fabricante de los otros ensayos de PECES con ANP, como E. coli/P. aeruginosa, el límite de detección (LOD) es de 105 UFC. En cultivos mixtos, es posible que un organismo crezca más que el otro y que la botella señale positivo en el dispositivo de hemocultivo automatizado antes de que ambos organismos alcancen este límite para el ensayo de PECES con ANP. La especificidad de la prueba fue de 98.2% (162/165). Los cultivos mixtos que contenían más de un aislado distinto de E. coli, P. aeruginosa o K. pneumoniae (28 en total) se contaron una vez en los cálculos de especificidad, ya que solo se podía esperar un resultado negativo a la vez. Una muestra de Enterobacter cloacae dio un resultado falso positivo de E. coli (verde) (negativo en pruebas repetidas), y una muestra de Acinetobacter baumannii dio un resultado falso positivo de P. aeruginosa (rojo) (aislado/muestra no disponible para pruebas adicionales). Otro falso positivo P. el resultado de aeruginosa (rojo) se produjo con una muestra que contenía Acinetobacter radiorresistens, un aislado clínico poco frecuente. El análisis de secuencias disponibles públicamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) reveló una similitud parcial de secuencias complementarias para A. radioresistens con la sonda PNA P. aeruginosa.

La selección inicial inadecuada de antibióticos y los retrasos en el inicio de la terapia antimicrobiana eficaz tienen un impacto adverso en las tasas de mortalidad en pacientes con ICB de GNB (6, 7, 9) y, en el caso de las ICB de Pseudomonas, se han asociado con una estancia hospitalaria más prolongada (9). Identificación rápida de E. coli, P. aeruginosa o K. la pneumoniae de los frascos de hemocultivos tiene el potencial de influir en las decisiones clínicas al permitir la elección temprana de una terapia antimicrobiana dirigida eficaz y, por lo tanto, mejores resultados para los pacientes y una duración reducida de las estancias en el hospital. Una vez que se ha identificado la especie, se puede elegir un régimen terapéutico con actividad antipseudomonal como tobramicina o piperacilina-tazobactam para la infección por P. aeruginosa y ceftriaxona u otros medicamentos adecuados para la bacteriemia por E. coli. Identificación temprana de K. pneumoniae en el hemocultivo permitiría iniciar rápidamente el tratamiento adecuado basado en el patrón de resistencia de este organismo en una institución dada, como la tasa de transporte de β-lactamasa de espectro extendido (BLEE) o la prevalencia de resistencia a carbapenem. Se ha demostrado que los resultados de Rapid PNA FISH negativos para E. coli, P. aeruginosa o K. pneumoniae indican un aumento en la probabilidad de que un aislado sea resistente a una cefalosporina, lo que respalda aún más el concepto de identificación rápida de patógenos que afecta las decisiones terapéuticas (5).

Este estudio demostró que el PNA FISH de semáforo GNR es un ensayo altamente sensible y específico para identificar el GNB más común recuperado de botellas de hemocultivos recién positivas. El tiempo de obtención de resultados para los PECES con ANP del semáforo GNR de un hemocultivo positivo es de aproximadamente 90 minutos (el tiempo de tecnólogo práctico es de aproximadamente 10 minutos por prueba), en comparación con 1 a 3 días para los métodos fenotípicos convencionales. Si bien la evaluación del costo real de la implementación de PNA FISH en semáforos de GNR estaba más allá del alcance de este estudio, el costo aproximado por prueba basado en el precio de lista del fabricante es de $39 (sin incluir los controles), con un reembolso de Medicare de Medicare 84.66. Como sugieren los estudios de otros ensayos de PNA FISH, los gastos de laboratorio para la implementación de PNA FISH de semáforos GNR serían justificables cuando se miden en comparación con los mejores resultados para los pacientes, la reducción de la duración de las estancias en el hospital y el uso juicioso de la terapia antimicrobiana (1, 2, 3). El efecto directo del PNA FISH del semáforo de GNR en la selección de la terapia empírica apropiada, los resultados posteriores de los pacientes y los beneficios en función de los costos serían áreas de interés para estudios futuros.