La basílica fue fundada por el emperador romano Constantino I sobre el lugar del entierro de San Pablo, donde se dice que, después de la ejecución del Apóstol, sus seguidores erigieron un monumento, llamado cella memoriae. Esta primera basílica fue consagrada por el Papa Silvestre en 324.
En 386, el emperador Teodosio I comenzó a erigir una basílica mucho más grande y hermosa con una nave y cuatro naves con un crucero. Probablemente fue consagrada alrededor del año 402 por el Papa Inocencio I. El trabajo, incluidos los mosaicos, no se completó hasta el pontificado de León I (440-461). En el siglo V era más grande que la Antigua Basílica de San Pedro. El poeta cristiano Prudencio, que lo vio en la época del emperador Honorio (395-423), describe el esplendor del monumento en algunas líneas expresivas.
Bajo Leo I, se llevaron a cabo extensos trabajos de reparación tras el colapso del techo a causa de un incendio o un rayo. En particular, se elevó el crucero (es decir, el área alrededor de la tumba de Pablo) y se instaló un nuevo altar mayor y un presbiterio. Esta fue probablemente la primera vez que se colocó un altar sobre la tumba de San Pablo, que permaneció intacta, pero en gran parte bajo tierra, dados los niveles de piso recién elevados de León. Leo también fue responsable de arreglar el arco de triunfo y de restaurar una fuente en el patio (atrio).
Bajo el Papa San Gregorio Magno (590-604) el altar mayor y el presbiterio fueron modificados extensamente. El pavimento del crucero se elevó y se colocó un nuevo altar sobre el altar anterior erigido por León I. La posición estaba directamente sobre el sarcófago de San Pablo.
En ese período había dos monasterios cerca de la basílica: San Aristus para hombres y San Stefano para mujeres. Las misas eran celebradas por un cuerpo especial de clérigos instituido por el Papa Simplicio. Con el tiempo, los monasterios y el clero de la basílica declinaron; el Papa San Gregorio II restauró los primeros y confió a los monjes el cuidado de la basílica.
Al estar fuera de las murallas Aurelianas, la basílica fue dañada en el siglo IX durante una incursión sarracena. En consecuencia, el Papa Juan VIII (872-82) fortificó la basílica, el monasterio y las viviendas de los campesinos, formando la ciudad de Johannispolis (en italiano, Giovannipoli) que existió hasta 1348, cuando un terremoto la destruyó totalmente.
En 937, cuando San Odón de Cluny llegó a Roma, Alberico II de Spoleto, Patricio de Roma, confió el monasterio y la basílica a su congregación y Odón puso a Balduino de Monte Cassino a cargo. El papa Gregorio VII fue abad del monasterio y en su tiempo Pantaleone, un rico comerciante de Amalfi que vivía en Constantinopla, presentó las puertas de bronce de la basílica mayor, que fueron ejecutadas por artistas constantinopolitanos; las puertas están inscritas con la oración de Pantaleone para que se le abran las «puertas de la vida». El Papa Martín V lo confió a los monjes de la Congregación de Monte Cassino. Luego se convirtió en una abadía nullius. La jurisdicción del abad se extendía sobre los distritos de Civitella San Paolo, Leprignano y Nazzano, todos los cuales formaban parroquias.
El elegante claustro del monasterio fue construido entre 1220 y 1241.
Desde 1215 hasta 1964 fue la sede del Patriarca Latino de Alejandría.
El 15 de julio de 1823, un trabajador que reparaba el plomo del techo inició un incendio que llevó a la destrucción casi total de esta basílica, que, única entre todas las iglesias de Roma, había conservado gran parte de su carácter original durante 1435 años.
En 1825, León XII publicó la encíclica Ad plurimas alentando las donaciones para la reconstrucción. Unos meses más tarde, ordenó que la basílica se reconstruyera exactamente como había sido cuando era nueva en el siglo IV, aunque también estipuló que los elementos preciosos de períodos posteriores, como los mosaicos medievales y el tabernáculo, también se repararan y conservaran. Estas directrices resultaron poco realistas por diversas razones y pronto dejaron de aplicarse. El resultado es una basílica reconstruida que solo tiene un parecido general con la original, y de ninguna manera es idéntica a ella. La reconstrucción se encomendó inicialmente al arquitecto Pasquale Belli, a quien sucedió a su muerte en 1833 Luigi Poletti, quien supervisó el proyecto hasta su muerte en 1869 y fue responsable de la mayor parte de la obra. Muchos elementos que habían sobrevivido al incendio fueron reutilizados en la reconstrucción. Muchos gobernantes extranjeros también hicieron contribuciones. Muhammad Ali Pasha, Virrey de Egipto, dio columnas de alabastro, mientras que el Emperador de Rusia donó la preciosa malaquita y el lapislázuli que se utilizaron en algunos de los frentes del altar. El crucero y el altar mayor fueron consagrados en 1840 y esa parte de la basílica fue reabierta. Todo el edificio fue reconsagrado en 1854 en presencia del Papa Pío IX y cincuenta cardenales. Sin embargo, muchas de las características del edificio aún estaban por ejecutarse en esa fecha, y el trabajo finalmente se extendió hasta el siglo XX. El cuadripórtico que mira hacia el Tíber fue completado por el Gobierno italiano, que declaró la iglesia monumento nacional. El 23 de abril de 1891, una explosión en el almacén de pólvora de Forte Portuense destruyó las vidrieras de la basílica.
El 31 de mayo de 2005, el Papa Benedicto XVI ordenó que la basílica quedara bajo el control de un arcipreste y nombró al arzobispo Andrea Cordero Lanza di Montezemolo como su primer arcipreste.