Gasteyer desarrolló una experiencia de comedia con el grupo de comedia de improvisación de Los Ángeles The Groundlings. Interpretó pequeños papeles en Seinfeld (como un cliente condenado al fracaso de The Soup Nazi), así como en los programas Party of Five, Frasier, Hope & Gloria y NYPD Blue. En 1996, Gasteyer se unió al elenco de Saturday Night Live. Entre sus personajes más populares se encontraban el profesor de música de secundaria Bobbie Mohan-Culp, la presentadora de Platos Deliciosos de la Radio Pública Nacional Margaret Jo McCullen, la cantante feminista de Lilith Fair, Cinder Calhoun, y sus impresiones de Martha Stewart y Celine Dion. En 2000, ella y Chris Parnell audicionaron para suceder a Colin Quinn como co-presentadores del segmento de parodia de noticias Weekend Update, pero los puestos finalmente fueron para Tina Fey y Jimmy Fallon.
Después de seis temporadas, Gasteyer dejó SNL en 2002. Posteriormente, apareció en varios programas de televisión, películas y producciones teatrales. En 2004, Gasteyer interpretó a la madre del personaje principal Cady Heron (Lindsay Lohan) en el largometraje Mean Girls, escrito por Tina Fey, compañera de reparto de SNL. La película también contó con otros ex compañeros de reparto de SNL, incluidos Fey, Tim Meadows y Amy Poehler. También apareció en la película musical Reefer Madness de Showtime de 2005 como Mae, la novia condenada de Jack y dueña de la guarida de los refrigerados.
Gasteyer protagonizó una reposición de la Ópera de tres centavos en Broadway como Mrs.Peachum, junto con Jim Dale, Alan Cumming y Cyndi Lauper. La producción se realizó del 24 de marzo al 25 de junio de 2006.
El 24 de junio de 2005, Gasteyer originó el papel de Elphaba en la producción de Chicago del musical Wicked, junto a Kate Reinders como Glinda. La producción se inauguró el 13 de julio de 2005. Gasteyer fue nominada para un Premio Jefferson por su actuación. Interpretó su última actuación el 22 de enero de 2006, reemplazada por Kristy Cates. Más tarde repitió el papel en la producción de Broadway del 10 de octubre de 2006 al 7 de enero de 2007, reemplazando a Eden Espinosa.
El 12 de abril de 2007, los medios de comunicación anunciaron que Gasteyer se había unido al elenco del nuevo musical, Writing Arthur, para el Festival de Obras Nuevas de 2007 para TheatreWorks en California, que se llevó a cabo del 14 al 22 de abril. Gasteyer actuó en Chicago en el musical Stephen Sondheim Passion en el Teatro Shakespeare de Chicago del 2 de octubre de 2007 al 11 de noviembre de 2007.
Fue elegida originalmente como Gloria en los Bises! Producción de la serie de verano de Damn Yankees, pero debido a una lesión durante los ensayos, fue reemplazada por Megan Lawrence. Gasteyer participó en la lectura de la versión musical de Broadway de The First Wives Club.
Interpretó a Kitty Dean en The Broadway play, The Royal Family, que comenzó a actuar en el Teatro Samuel J. Friedman el 15 de septiembre de 2009 y se inauguró oficialmente el 8 de octubre de 2009. El espectáculo concluyó su carrera el 13 de diciembre de 2009. Gasteyer también interpretó a Frisco Kate Fothergill en City Centers Encores! producción de Girl Crazy, del 19 al 22 de noviembre de 2009.
Regresó a Saturday Night Live para un episodio especial del Día de la Madre el 8 de mayo de 2010, y para otro episodio del Día de la Madre el 11 de mayo de 2012.
Gasteyer apareció en la octava temporada de Curb Your Enthusiasm como la novia de Larry David.
De 2011 a 2014, Gasteyer co-protagonizó como Sheila Shay en la serie de comedia de ABC Suburgatory, y a partir de marzo de 2013, fue portavoz del plan de dieta Weight Watchers.
En 2014, aprovechando su formación como cantante, Gasteyer grabó y lanzó I’m Hip, un álbum de estándares de jazz. «Un Julepe de menta» fue una de las selecciones que incluyó. En 2015, interpretó a Mimi Schwinn en el New York City Center Encores! Renacimiento off-Broadway del musical A New Brain, que también aparece en la grabación del elenco.
De 2016 a 2017, Gasteyer tuvo un papel protagónico en el éxito de culto de TBS People of Earth, como líder de un grupo de apoyo de abducidos alienígenas.
En octubre de 2019, lanzó el álbum navideño Sugar & Booze. Gasteyer más tarde apareció como concursante en la segunda temporada de The Masked Singer bajo el disfraz de «The Tree», terminando la competencia en sexto lugar.
En febrero de 2020, Gasteyer interpretará el papel de Katherine Hastings en el piloto de comedia de NBC American Auto, que fue escrito por Justin Spitzer. En septiembre y octubre de 2020, hizo la voz de un panda rojo llamado Nut en una serie animada para adultos titulada Magical Girl Friendship Squad.