| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
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 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
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| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein strukturen: | Pfam | PDB | PDBsum | |||
Taq PolA hat eine ähnliche Gesamtstruktur wie E. coli PolA. Die mittlere 3′-5′-Exonuklease-Domäne, die für das Korrekturlesen verantwortlich ist, wurde dramatisch verändert und ist nicht funktionsfähig. Es hat eine funktionelle 5′-3′ Exonuklease-Domäne am Aminoterminal, wie unten beschrieben. Die verbleibenden zwei Domänen wirken koordiniert über gekoppelte Domänenbewegungen.
Exonuklease-Domainbearbeiten
Taq-Polymerase Exonuklease ist eine Domäne, die im Aminoterminal der Taq-DNA-Polymerase I (thermostabil) vorkommt. Es nimmt ein Ribonuklease-H-ähnliches Motiv an. Die Domäne verleiht der Polymerase 5′-3′-Exonukleaseaktivität.
Im Gegensatz zur gleichen Domäne in E. coli, die Primer abbauen würde und für die PCR-Verwendung durch Digestion entfernt werden muss, soll diese Domäne den Primer nicht abbauen. Diese Aktivität wird in der TaqMan-Sonde verwendet: wenn die Tochterstränge gebildet werden, kommen die zum Templat komplementären Sonden mit der Polymerase in Kontakt und werden in fluoreszierende Stücke gespalten.
Bindung mit DNAEdit
Taq-Polymerase ist an ihrem Polymerase-Aktiv-Zentrum-Spalt mit dem stumpfen Ende der Duplex-DNA gebunden. Da die Taq-Polymerase mit der gebundenen DNA in Kontakt steht, bilden ihre Seitenketten Wasserstoffbrückenbindungen mit den Purinen und Pyrimidinen der DNA. Dieselbe Region der Taq-Polymerase, die an DNA gebunden ist, bindet auch an Exonuklease. Diese an die Taq-Polymerase gebundenen Strukturen haben unterschiedliche Wechselwirkungen.
MutantsEdit
Ein ortsgerichtetes Mutagenese-Experiment, das die vestigale 3′-5′-Exonuklease-Aktivität um den Faktor 2 verbessert, wurde berichtet, aber es wurde nie berichtet, ob dies die Fehlerrate verringert. Nach einer ähnlichen Linie des Denkens, Chimäre Proteine wurden durch Cherry-Picking-Domänen aus E. coli, Taq und T. neapolitana Polymerase I. Swapping aus der vestigalen Domäne für eine funktionelle aus E. coli erstellt ein Protein mit Korrekturlesefähigkeit, aber eine niedrigere optimale Temperatur und niedrige Thermostabilität.
Es wurden Versionen der Polymerase ohne die 5′-3′-Exonuklease-Domäne hergestellt, unter denen Klentaq oder das Stoffel-Fragment am bekanntesten sind. Das völlige Fehlen einer Exonukleaseaktivität macht diese Varianten sowohl für Primer mit Sekundärstruktur als auch zum Kopieren zirkulärer Moleküle geeignet. Andere Variationen umfassen die Verwendung von Klentaq mit einer High-Fidelity-Polymerase, einer Thermosequenase, die Substrate wie die T7-DNA-Polymerase erkennt, Mutanten mit höheren Toleranzen gegenüber Inhibitoren oder „Domain-Tagged“ -Versionen, die ein zusätzliches Helix-Haarnadel-Helix-Motiv um die katalytische Stelle haben, um die DNA trotz widriger Bedingungen fester zu halten.
Bedeutung bei der Erkennung von Krankheitenbearbeiten
Aufgrund der Verbesserungen der Taq-Polymerase bei der PCR-DNA-Replikation: höhere Spezifität, weniger unspezifische Produkte und einfachere Prozesse und Geräte haben maßgeblich zur Erkennung von Krankheiten beigetragen. „Die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei der Diagnose von Infektionskrankheiten hat dazu geführt, dass Krankheiten aufgrund anspruchsvoller Krankheitserreger frühzeitig diagnostiziert und angemessen behandelt, die antimikrobielle Empfindlichkeit langsam wachsender Organismen bestimmt und das Infektionsrisiko ermittelt werden kann.“ Die Implementierung der Taq-Polymerase hat unzählige Leben gerettet. Es hat eine wesentliche Rolle bei der Erkennung vieler der schlimmsten Krankheiten der Welt gespielt, darunter Tuberkulose, Streptokokken-Pharyngitis, atypische Pneumonie, AIDS, Masern, Hepatitis und ulzerative Urogenitalinfektionen. Die PCR, die Methode, mit der Kopien spezifischer DNA-Proben nachgebildet werden, ermöglicht den Nachweis von Krankheiten, indem eine bestimmte DNA-Sequenz eines Zielpathogens aus einer Patientenprobe entnommen und Spurenmengen der indikativen Sequenzen durch bis zu milliardenfaches Kopieren amplifiziert werden. Obwohl dies die genaueste Methode zur Erkennung von Krankheiten ist, insbesondere für HIV, wird sie aufgrund der relativ hohen Kosten, des Arbeitsaufwands und des Zeitaufwands nicht so oft durchgeführt wie alternative, minderwertige Tests.
Die Abhängigkeit von Taq-Polymerase als Katalysator für den PCR-Replikationsprozess wurde während der COVID-19-Pandemie von 2020 hervorgehoben. Ein Mangel an dem notwendigen Enzym hat die Fähigkeit der Länder weltweit beeinträchtigt, Testkits für das Virus herzustellen. Ohne Taq-Polymerase ist der Krankheitserkennungsprozess viel langsamer und langwieriger.
Trotz der Vorteile der Verwendung von Taq-Polymerase beim Nachweis von PCR-Erkrankungen ist das Enzym nicht ohne Mängel. Retrovirale Erkrankungen: HIV, HTLV-1 und HTLV-II; enthalten häufig Mutationen von Guanin zu Adenin in ihrem Genom. Mutationen wie diese ermöglichen es PCR-Tests, die Krankheiten nachzuweisen, aber die relativ niedrige Wiedergabetreue der Taq-Polymerase führt dazu, dass dieselbe G-zu-A-Mutation auftritt und möglicherweise zu einem falsch positiven Testergebnis führt.