Problemlösungstest: Dämpfung: Ein Mechanismus zur Regulierung der bakteriellen Tryptophanbiosynthese

DAS EXPERIMENT

Wie im Problemlösungstest in der letzten Ausgabe von Biochemistry and Molecular Biology Education vorgestellt , wird die Transkriptionseinheit, die die Enzyme der Tryptophanbiosynthese kodiert, durch den trp1-Repressor reguliert: tryptophan, das als Corepressor wirkt, bindet und aktiviert den Repressor, der wiederum an die Operatorregion bindet und die Bewegung der RNA-Polymerase und damit die Transkription der Strukturgene trp E, D, C, B und A blockiert, die für Enzyme der Tryptophansynthese kodieren. Diese Hemmung ist jedoch „undicht“: Es gibt eine gewisse Transkription des Operons auch in Gegenwart von Tryptophan; Dies würde Energie für die Herstellung von Enzymen verschwenden, die nicht benötigt werden. Ein zweiter Regulationsmechanismus, Attenuation genannt, schlägt diese Resttranskription auf dem trp-Operon nieder .

Eine kurze Region zwischen dem Operator und dem ersten Strukturgen (trp E), Leader genannt (Abb. 1), ist für die Dämpfung verantwortlich. Die Leadersequenz ist ∼140 Basepaare lang und kodiert für die 5’‐Endregion der trp-mRNA vor dem Initiationscodon des ersten Strukturgens. Die Leader-Region der trp-mRNA hat eine einzigartige Struktur (Abb. 2a). Es enthält einen kurzen offenen Leserahmen (ORF), der für ein Oligopeptid namens Leader-Peptid kodiert. Zwei palindrome Sequenzen (Region 1/2 und Region 3/4) erzeugen ein selbstkomplementäres Basepairing, das zur Bildung von Haarnadelstrukturen führt. Auf die zweite Haarnadel (Region 3/4) folgt eine Strecke von uns, wodurch ein strukturelles Merkmal bestimmter Transkriptionsterminatoren entsteht. Der für das Leader-Peptid kodierende ORF überlappt sich mit Region 1 und enthält zwei Codons für Tryptophan. Darüber hinaus sind die Regionen 2 und 3 nicht nur komplementär zu den Regionen 1 bzw. 4, sondern auch zueinander. Diese ziemlich komplizierte Struktur der Leader-Sequenz schafft die Voraussetzungen für einen ausgeklügelten Regulationsmechanismus für die Transkription des Operons.

Die Dämpfung basiert auf gekoppelter Transkription / Translation in Prokaryoten: Ribosomen binden an im Entstehen begriffene mRNAs und bilden Chromosom–Polysom-Komplexe; Somit beginnt die Proteinsynthese mit wachsenden mRNA-Ketten. Wenn Tryptophan nicht verfügbar ist (Abb. 2b), das Ribosom bleibt im Leader-Peptid stehen, das ORFs codiert, die Haarnadel 1/2 stören und zur Bildung von Haarnadel 2/3 führen. Diese Haarnadel verhindert die Erzeugung der Terminierungshaarnadel 3/4 (Attenuator genannt), und somit kann die RNA‐Polymerase die Dehnung fortsetzen und transkribiert das gesamte Operon in ein Transkript voller Länge. Wenn jedoch Tryptophan vorhanden ist, bleibt das Ribosom in Bewegung und verhindert die Bildung von Haarnadel 1/2 und 2/3 (Abb. 2c). Die Abschwächer-Haarnadel 3/4 kann sich bilden und beendet die Transkription. Das Leader-Peptid und die kurze Leader-RNA werden dann schnell abgebaut, und die Strukturgene werden nicht transkribiert. Überprüfen Sie den Mechanismus und lösen Sie den folgenden Test.

In diesem fiktiven Experiment werden zwei trp-Codonmutanten verwendet: In einem von ihnen wurden die beiden für Tryptophan kodierenden UGG-Codons in GGGs umgewandelt (Codons für Glycin; im gesamten Test als „trp-Codonmutante“ bezeichnet); in dem anderen wurde Region 3 deletiert („Region 3 Mutant“).

Wildtyp E. coli-Zellen, „trp-Codon-Mutanten“ und „Region 3-Mutanten“ werden in einem reichen Medium kultiviert, das alle Aminosäuren (einschließlich Tryptophan) in optimalen Konzentrationen enthält. Was passiert mit ihnen?

Experimentanalyse

Dieselben Zellen werden nun in einem Medium gezüchtet, das alle Aminosäuren außer Tryptophan enthält. Wie verhalten sich die Zellen unter solchen Bedingungen?

Experimentanalyse