1 Theorie
Oligonukleotide werden durch Zugabe jeweils einer Base synthetisiert, die sich vom 3′- bis zum 5′-Ende erstreckt und an einem Festphasenträger befestigt ist. Wenn die chemische Synthese des Oligonukleotids abgeschlossen ist, wird die DNA-Kette durch Inkubation mit Ammoniumhydroxid vom festen Träger gelöst. Ammonium wirkt auch als deprotektives Mittel und spaltet die Gruppen ab, die die Phosphate in den Phosphodiesterbindungen schützen. Danach wird heißes Ammoniak zugegeben, um die Schutzgruppen aus den exocyclischen Aminogruppen von Desoxyadenosin, Desoxycytosin und Desoxyguanosin zu hydrolysieren. Das Oligonukleotid könnte dem Anwender in der Ammoniaklösung als Rohpräparat zugeführt werden. In diesem Fall kann es erforderlich sein, vor der Verwendung einen zusätzlichen Schritt durchzuführen, um die Salze und Nebenprodukte aus der während der Entschützung erzeugten Oligonukleotidpräparation zu entfernen.
Nach der Entschützung wird das Oligonukleotidpräparat üblicherweise entsalzt, quantifiziert, in einem Lyophilisator zur Trockne eingedampft und dem Anwender in Form eines Pulvers zugeführt. Die entsalzte Oligonukleotidlösung enthält das Oligonukleotid in voller Länge, aber auch eine Mischung von abgeschnittenen Produkten, die während der chemischen Synthese akkumuliert wurden. Eine Kürzung tritt auf, wenn die angegebene Basis im entsprechenden Zyklus nicht zur Kette hinzugefügt werden kann (Hecker & Rill, 1998). Somit wird der Prozentsatz der in der Zubereitung akkumulierten abgeschnittenen Produkte durch die Syntheseeffizienz (den Anteil des Produkts voller Länge nach der Synthese) und die Länge des Moleküls bestimmt. Lange Oligonukleotide, die mehr Zyklen benötigen, um synthetisiert zu werden, sind weniger rein als kurze Oligonukleotide. Diese Fehler können in einigen Anwendungen mit dem Produkt in voller Länge konkurrieren und müssen möglicherweise entfernt werden, bevor das Oligonukleotid verwendet werden kann. Entsalzte Oligonukleotidpräparationen sind jedoch üblicherweise für viele Anwendungen, wie Standard-PCR oder Microarrays, geeignet, insbesondere wenn das Oligonukleotid < 20 Nukleotide lang ist.
Eine weitere Reinigung für Oligonukleotide, die länger als 50 Basen sind, wird empfohlen, da der Prozentsatz des Volllängenprodukts in der Zubereitung typischerweise nicht höher als 80% ist. Für anspruchsvolle Anwendungen, bei denen die genaue Länge des Oligonukleotids wichtig ist, wie z. B. Gel-Shift-Assays, ortsgerichtete Mutagenese, Sequenzierung, Herstellung von Klonierungsadaptern oder Erststrang-cDNA-Synthese zur Generierung von Bibliotheken, wird eine zusätzliche Reinigung empfohlen, auch für kürzere Oligonukleotide (siehe weitere Informationen zu den obigen Techniken zu Standard-In-vitro-Assays für Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen – Gel-Shift-Assays für RNA- und DNA-Bindung und ortsgerichtete Mutagenese).
Eine Reinigung kann nach der Synthese oder nach enzymatischer Modifikation des Oligonukleotids erforderlich sein. Es gibt mehrere Methoden, um dies zu erreichen, und die Wahl hängt von der Art des Oligonukleotids und der Anwendung ab, für die es bestimmt ist.
Die Reverse-Phase-HPLC-Reinigung basiert auf Hydrophobie. Es verwendet eine unpolare stationäre Phase und wässrige Puffer und organische Lösungsmittel als mobile Phase, um die Analyten zu eluieren; polare Verbindungen werden zuerst eluiert, während unpolare Verbindungen zurückgehalten werden. Dies ist die beste Methode zur Reinigung von Oligonukleotiden, die mit einer hydrophoben Gruppe modifiziert sind, wie Biotin, Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen oder NHS-Ester-Konjugationen. Die Massenrückgewinnung ist höher als bei Verwendung einer PAGE-Reinigung und es ist der Reinigung größerer Mengen an Oligonukleotiden (mmol-Skala) zugänglich, obwohl unvollständige Produkte nicht so effektiv entfernt werden. Oligonukleotidreinigungspatronen, basierend auf der Umkehrphasenchromatographie, bieten eine schnelle Methode zum Entsalzen und Reinigen von Oligonukleotiden.
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) löst Oligonukleotide entsprechend ihrer Länge auf und bietet dadurch eine ausreichende Auflösung, um Produkte in voller Länge von ausgefallenen Molekülen zu unterscheiden (Atkinson und Smith, 1984). Polyacrylamidgele sind wirksamer zum Trennen kleiner DNA-Fragmente als Agarosegele (siehe Analyse von RNA durch analytische Polyacrylamidgelelektrophorese und Agarosegelelektrophorese). Der einzige Nachteil von Polyacrylamidgelen besteht darin, dass sie schwieriger herzustellen und zu handhaben sind als Agarosegele. Polyacrylamidgele werden vertikal in einem konstanten elektrischen Feld betrieben. Nach der Elektrophorese wird das Oligonukleotid aus dem Gel eluiert und unter Verwendung von Ethanolfällung (weitere Informationen zur Präzipitation von Nukleinsäuren bei RNA–Aufreinigungs- Präzipitationsmethoden) oder Umkehrphasenchromatographie eingeengt. Dies ist die Methode der Wahl, wenn der höchste Prozentsatz an Oligonukleotiden voller Länge für anspruchsvolle Anwendungen gewünscht wird. Es wird auch dringend für Oligonukleotide empfohlen, die länger als 30 Basen sind. Außerdem können mehrere Proben gleichzeitig ausgeführt werden, und es ist keine teure Ausrüstung erforderlich. Der einzige Nachteil dieser Technik ist die geringe Menge an Oligonukleotid, die pro Reinigung erhalten wird. Typischerweise werden Oligonukleotide im Maßstab von 1 µmol oder weniger verwendet, und die Massenrückgewinnung nach der PAGE-Reinigung beträgt < 50% und bei modifizierten Oligonukleotiden sogar noch niedriger. Obwohl die Ausbeute gering ist, ist sie dennoch für die meisten biochemischen Anwendungen zufriedenstellend.
Die Oligonukleotidzubereitung wird in einer Menge von mindestens 1 mg pro Spur auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel geladen. Der Bereich der Auflösung des Gels hängt von der Konzentration des Polyacrylamids ab. Für kurze Oligonukleotide (15 bis 35 Basen) werden 13-15% ige Polyacrylamidgele empfohlen; für längere Oligonukleotide (35 bis 70 Basen) werden 8-13% ige Polyacrylamidgele empfohlen. Der Prozentsatz des Gels sollte an das laufende System angepasst werden. Wir verwenden normalerweise das Bio-Rad Mini Protean II-System und führen 15% Gele zur Reinigung von Oligonukleotiden mit einer Länge von 25 Basen durch. Nach Identifizierung der richtigen Bande durch UV-Visualisierung wird die Bande herausgeschnitten und aus dem Gel extrahiert.
In diesem Kapitel werden zwei verschiedene Methoden zur Reinigung von Oligonukleotiden aus Polyacrylamidgelen beschrieben. Die einfachste Methode ist die Elution mittels Diffusion. Dies basiert auf der Bewegung von Molekülen aus einem Bereich höherer Konzentration in einen Bereich niedrigerer Konzentration. Das Ergebnis der Diffusion ist eine allmähliche Vermischung des Materials. Diese Methode ist zeitaufwendig, erfordert jedoch nicht zu viel Arbeit oder Ausrüstung. Grundsätzlich wird die Polyacrylamidbande, die das interessierende Oligonukleotid enthält, in kleine Stücke geschnitten und mit Elutionspuffer bedeckt. Nach Inkubation wird die DNA aus dem Überstand durch Ethanolfällung gereinigt. Die Ausbeute ist begrenzt, zwischen 20% und 70%, abhängig von der Länge des Oligonukleotids. Je größer die Menge des verwendeten Elutionspuffers ist, desto mehr Oligonukleotid wird aus dem Gel diffundiert.
Die zweite Methode ist die Elektroelution in einen Dialysebeutel (McDonell et al., 1977). Das das Oligonukleotid enthaltende Gelstück wird herausgeschnitten und in einen Dialysebeutel mit Puffer gegeben. Durch Anlegen eines elektrischen Stroms wandert die DNA aus dem Gel in den Dialysebeutelpuffer. Aus diesem Puffer wird das Oligonukleotid gewonnen und gereinigt. Mit dieser Methode kann das Oligonukleotid mit einer guten Ausbeute isoliert werden, obwohl es zeitaufwendig ist, wenn eine große Anzahl von Proben gleichzeitig gereinigt wird, da es das Einführen jeder Gelbande in einzelne Dialysebeutel erfordert. Diese Methode funktioniert auch gut für größere DNA-Fragmente und kann sogar verwendet werden, um DNA aus Agarosegelen zu extrahieren.