Bewertung der IC50-Spiegel unmittelbar nach der Behandlung mit Antikrebsreagenzien unter Verwendung eines Echtzeit‑Zellüberwachungsgeräts

Einführung

Ein Echtzeit-Zell-Monitoring-Analyse-System (RTCA) wurde zuvor für die kontinuierliche Überwachung adhärenter Zellkulturen entwickelt (1). Diese markierungsfreie und nicht-invasive Methode basiert auf der Messung der elektrischen Impedanz (Cell Index, CI) zwischen interdigitierten Regionen auf der Basis von Gewebekulturplatten. Die CI-Messung liefert quantitative Informationen über den biologischen Status der anhaftenden Zellen. Eigentlich ist die Bedeutung von CI die Anzahl der Überlebenszelleauf der Oberfläche der E-Platte. Diese Daten umfassen die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie als Echtzeitprofil (2-4). RTCAsystem ist zur Früherkennung der Zellreaktion als adynamischer Phänotyp gegen einige Reagenzien bekannt (5).

In unserer vorherigen Studie wurde die Zytotoxizität von Imatinib beim oralen Plattenepithelkarzinom (OSCC) anhand des WST bewertet-8(5– 3-(2- methoxy- 4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H- tetrazol- 3- ium) assay als Endpunktmessung (6) und später mit einem RTCA-System (7).Endpunktmessungen mit MTT (3–2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) und WST-8-Assays werden häufig zur Bewertung der Zytotoxizität verwendet. Solche Assays sind jedoch durch Variationen in der Wirkung verschiedener Krebsmedikamente auf verschiedene Zelllinien begrenzt. Darüber hinaus sind die IC50-Werte, die durch In-vitro-Endpunkttests berechnet werden, tendenziell höher als die effektiven Konzentrationen in vivo (8,9).

In unserer vorherigen Studie waren die mit dem RTCA-System gemessenen IC50-Werte niedriger als die mit dem WST-8-Assay gemessenen, was darauf hindeutet, dass das RTCA-System die Zytotoxizität und den Einfluss von Imatinib auf die Zelladhäsion empfindlich bewerten kann. Es ist jedoch unklar, ob die Bewertung derIC50-Werte anderer Krebsmedikamente unter Verwendung des RTCA-Systems wäre nützlich, da es Unterschiede in den zytotoxischen Reaktionen zwischen molekularen Zielarzneimitteln wie Imatinib und Antikrebsmitteln im Laufe der Zeit gibt.

In dieser Studie müssen wir die Art der Zelllinien auswählen, um den Unterschied des Zellreaktionsprofils gegen Antikrebsreagenzien in Echtzeit mit dem RTCA-System zu bestimmen.Nichtinvasive SQUU-A-Zelllinie und invasive SQUU-B-Zelllinie, die aus lokalen rezidivierenden Zungenkrebstumoren bei einem einzelnen Patienten hergestellt wurden, wurden ausgewählt, weil wir an der Metastasierung von SQUU-B-Zelllinien mit SQUU-A-Zelllinie und SQUU-Bcell-Linie (10-12). SAS-Zelllinien wurden aus etabliertschlecht differenziertes humanes Plattenepithelkarzinom der Zunge(13). Die NA-Zelllinie wurde als Fibronektin produzierende Zelllinie etabliert (14). Darüber hinaus wurde berichtet, dassdie Zytotoxizität von Antikrebsreagenzien in OSCC in SQUU-A-Zelllinien und SQUU-B-Zelllinien (15), SAS-Zelllinien (16) und NA-Zelllinien (17) unter Verwendung verschiedener herkömmlicher Methoden bewertet wurde.Aus diesem Grund haben wir in der vorliegenden Studie vier dieser Zelllinien mit jeweils einem charakteristischen Merkmal ausgewählt, die in früheren Studien auch in zytotoxischen Assays verwendet wurden.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues RTCA-Gerät, das für Echtzeitmessungen entwickelt wurde, und bewerteten die IC50-Werte als Skala zur Beurteilung der Zytotoxizität von vier Antikrebsmitteln in vier OSCC-Zelllinien. Dies ermöglichte es uns, Informationen über die beobachteten Variationen zwischen den verschiedenen Antikrebsreagenzien und Zelllinien in Echtzeit zu erhalten.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, 150 Profile unmittelbar nach Zugabe von Antikrebsmitteln unter Verwendung eines RTCA-Systems zu erhalten. Diese Studie zeigte den Vorteil der Bewertung der Zytotoxizität von Antikrebsmitteln mit einem RTCA-System im Vergleich zu einem Endpunkttest.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Materialien

5-Fluorouracil (5-FU) wurde auf 100 mM Indimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA).Doxifluridin und Carboplatin wurden in destilliertem Wasser auf 100 bzw. 50 mM verdünnt. Docetaxel wurde in Ethanol auf 10 mM verdünnt. Alle Antikrebsreagenzien wurden von Wako PureChemical Industries, Ltd. bezogen., (Osaka, Japan) und bei -20°C gelagert.

Zellkultur

Menschliche OSCC-Zelllinien SQUU-A, SQUU-B, SAS und nawurden aus menschlichen Zungenproben gewonnen. SQUU-A und SQUU-B, die freundlicherweise von Morifuji-Wilson M (Kumamoto University, Kumamoto, Japan) bereitgestellt wurden, wurden aus lokalen rezidivierenden Zungenkrebstumoren hergestellt (18). SAS (13,19,20) wargekauft von der Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japan). NA(14) wurde freundlicherweise von Dr.Jun-ichi Iwata (Kyushu University; Fukuoka, Japan) zur Verfügung gestellt. Alle Zelllinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) mit 10% fötalem Kälberserum (Biowest, Nuaille, Frankreich) bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit5% CO2.

Messung der OSCC-Zellproliferation durch den RTCA-Zytotoxizitätstest

CI wurde vom iCELLigence-System (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, USA) als RTCA-System. Allmonitoring wurde bei 37°C mit reguliertem CO2-Gehalt (5%) durchgeführt. E-Platten (Kulturplatten für das iCELLigence-System) mit 200 µl Kulturmedium pro Vertiefung wurden auf 37 ° C äquilibriert und CI unter diesen Bedingungen auf Null gesetzt. Zellen (2 × 104 Zellen / Vertiefung, sofern nicht anders angegeben) wurden in 560 µl Kulturmedium zugegeben Antikrebsmittel wurden 24 h nach der Aussaat der Zellen zugegeben. Der KI wurde 96 h nach der Aussaat in Echtzeit überwacht. Die IC50-Werte wurden mit der RTCAData-Analysesoftware Version 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

Die Acht-Punkte-Konzentration von vier Antikanzerreagenzien wurde basierend auf den Cmax-Werten in der vorherigen Studie festgelegt (21-25). Darüber hinaus wurden Zeitpunkte für 72 h einschließlich 24 h und 48 h festgelegt, die allgemeine Methoden zur Bewertung der Zytotoxizität im Endpunkttest waren.

Kurvenanpassung der ic50-Daten

Zur Berechnung der IC50-Werte haben wir die folgende sigmoidale Dosis-Wirkungs-Formel verwendet: Y=Niedriges CI + (Hohes CI-Niedriges CI) / {1 + 10 ^ (Log IC50-X)}, wobei ‚Niedriges CI‘ die minimalen CI-Werte darstellt, ‚Hohes CI‘ die maximalen Zellenindexwerte darstellt, Y der Zellenindex ist und X das Protokoll der Konzentration (M) ist.

Messung der OSCC-Zellproliferationdurch den WST-8-Assay

Nach der anfänglichen Aussaat und Kultur von OSCC-Zellen wurde das Kulturmedium entfernt und durch ein Antikanzeragens enthaltendes Medium ersetzt. Nach 24, 48 und 72 h Inkubation wurde jeder Vertiefung 20µl WST-8-Farbstoff (Cell Counting Kit-8; Dojindo Corporation, Tokio, Japan) zugesetzt. Nach 3 h wurden die Platten bei 450 nm/655 nm abgelesen. Die Zellüberlebensrate wurde unter Verwendung der Formel unten berechnet (7). ic50-Werte wurden durch lineare Approximationsregression des Prozentüberlebens im Vergleich zur Arzneimittelkonzentration berechnet.

Zellüberlebensrate (%)=(a-c)/(b-c) ×100(a=Absorption bei jeder Konzentration des Antikrebsreagenzes, b=Absorption bei 0 µM des Antikrebsreagenzes und c=Absorption des Rohlings).

Statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung(SD) von drei unabhängigen Experimenten angezeigt. Korrelationen ZWISCHENIC50-Werten, die mit dem RTCA-System und dem WST-8-Assay erhalten wurden, wurden vom Spearmantest auf statistische Signifikanz bewertet. Zweiseitige Werte von P<0.05 wurden als assignificant betrachtet.

Ergebnisse

Wirkung der Konzentration des Antikrebsmittels auf die OSCC-Zellproliferation unter Verwendung des RTCA-Systems

Wir bewerteten die Zytotoxizität von vier Antikrebsmitteln (5-FU, Doxifluridin, Carboplatin und Docetaxel) in vier CCC-Zelllinien, indem wir die CI-Werte für 96 h überwachten, nachdem die Zellen bei 2 × 104 Zellen / Well auf E-Platten ausgesät worden waren (Abb. 1–4). Die CI-Werte waren in allen vier OSCC-Zelllinien in adose-abhängiger Weise erniedrigt. Daher korrelierte die Abnahme der CI-Werte mit der Abnahme der Zelle number.As in Fig. 2, der CI-Wert forinvasive SQUU-B-Zelllinie war niedriger als die anderer OSCC cells.As in Fig. 3 zeigte das für die SAS-Zelllinie erhaltene CI-Profil einen verzögerten Anstieg nach 48 h. Wie in Fig. 4, die rate von proliferation und max CI wert in NA zelllinie waren höher als oneof andere zelllinien.

Echtzeitmessung der IC50-Profile von Antikrebsmitteln in OSCC-Zellen unter Verwendung des RTCA-Systems

Die IC50-Profile der vier Antikrebsmittel in den vier OSCC-Zelllinien wurden vom RTCA-System bestimmt und von der mit dem Instrument gelieferten kommerziellen Software berechnet (eine Teilmenge der SQUU-B-Daten ist in Abb. 5). Die IC50-Werte wurden 72 h nach Zugabe von Antikrebsmitteln aufgetragen. Die IC50-Werte bei 24, 48 und 72 h für alle vier Zelllinien sind in den Tabellen I–IV zusammengefasst. 5, gab es Zeitverzögerung in den zytotoxischen Reaktionen von 5-FU (Abb. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Während die Zelllebensfähigkeitskurven von TAU-B unter Verwendung des WST-8-Assays auch in ergänzenden Materialien gezeigt wurden (Abb. S5-S8). R2-Werte bei 72 h Afteraddition Antikrebs-Reagenzien in WST-8 Assay waren niedrig in fouranticancer Reagenzien im Vergleich zu einem von 24 h und 48 h. Theseresults zeigte, dass es wünschenswert ist, dass Endpunkt-Assay beperformed bei 24 h oder 48 h als allgemeines Protokoll verwendet werden. In thisstudy wurden die Zelllebensfähigkeitskurven der Probe WST-8 insupplemental Materialien gezeigt, weil es keine Neuheit gab, wie tocalculationvon Werten IC50 unter Verwendung der Probe WST-8.

Korrelationen zwischen Echtzeitmessungen von IC50-Werten mit dem RTCA-System und Endpunktmessungen von IC50-Werten mit dem WST-8assay in OSCC-Zellen

Wie in Abb. 6 wurden IC50-Werte bei 24, 48 und 72 h mit zwei Methoden aufgetragen. Die horizontale Achse zeigt IC50-Werte in Echtzeit, die mit dem RTCA-System gemessen wurden, während die Längsachse IC50-Sendewerte anzeigt, die mit dem WST-8-Assay gemessen wurden. Apositive Korrelation wurde zwischen den beiden Arten von assaymethod beobachtet, um die IC50 für jedes Antikrebsmittel zu messen.Die Ergebnisse von 5-FU, Doxifluridin, Carboplatin und Docetaxel waren y = 8,19 x + 346,02 (R2 = 0,94, rs =0,66, * P<0,05), y = 1,00 x+172,70 (R2 = 0,91, rs = 0,82, **P<0,01), y= 1,90 x +206,81 (R2 = 0,92, rs =0,96, **P<0,01), y= 13,53 x+0,08 (R2 = 0,95, rs=0,73, *P<0,05). Die Echtzeit-IC50-Werte waren tendenziell niedriger als die entsprechenden Endpunkt-IC50-Werte.

Diskussion

CI-Werte, die von der RTCA berechnet werden, stellen auch den Zellstatus dar (3). Wie in Fig. 1-5, SD-Werte von CI-Werten waren zu klein, um zu sehen. Beispielsweise sind alle SD-Werte in Fig.1 waren unter 0,05. Der Grund für die niedrigen CI-Werte von SQUU-B war, dass das Adhäsionsprotein E-Cadherin eine wesentliche Rolle bei der Metastasierung spielt, wobei reduzierte E-Cadherin-Spiegel die Zellmigration und Zellinvasion fördern (26). Der Grund für die hohen maximalen CI-Werte vonna wurde vorgeschlagen, dass berichtet wurde, dass Fibronektin die Zellproliferation und -adhäsion aufgrund der Eigenschaft vonna Zelllinie als Fibronektin produzierende Zelllinie (6). Somit Zellreaktionen jeder Zellliniegegen vier Antikrebsreagenzien waren variabel. Wir konnten in dieser Studie keinen kausalen Zusammenhang zwischen IC50-Werten und dem Merkmal von Zelllinien finden. Es ist jedoch wichtig, eine Zellreaktion in Echtzeit als CI-Profil zu erkennen, um die Zytotoxizität von Antikrebsreagenzien zu bewerten, wenn eine pharmazeutische Anwendung beim Menschen in Betracht gezogen wird.

Das IC50-Profil der SQUU-B-Zelllinie warbeschrieben in Abb. 5 als arepresentative IC50 profil weil es waren nodifferences in IC50 profil muster in gleichen zelllinie incase von gleichen reagenz, obwohl wir berechnet IC50 valuesin alle zelllinie mit vier anti-krebs-reagenzien. Wir fanden heraus, dass die 150 Profile für jedes Krebsmedikament und in jeder OSCC-Zelllinie variierten. Wie in Fig.5, 5-FU und Docetaxel benötigten mehr als 24 h (48 h in der Abbildung), um eine zytotoxische Wirkung auf die OSCC-Zellen auszuüben, während sich die IC50-Werte nach Zugabe von Doxifluridin und Carboplatin von etwa 24 h (48 h in der Abbildung) erholt hatten. Daher schlugen wir vor, dass die Unterschiede der Echtzeit-150-Profile durch Antikrebsreagenz verursacht wurden. Solche Beobachtungen wären ohne Echtzeitmessung mit der RTCA nicht möglich gewesen. Die Echtzeitüberwachung der 150 Werte ergab auch, dass sich diese Werte im Laufe der Zeit merklich änderten. Es besteht die Möglichkeit, Veränderungen mit herkömmlichen Methoden nicht nachzuweisen, da nur ein Zeitpunkt des IC50 nach der Behandlung mit dem Antikrebsmittel durch einen Endpunkttest bewertet wird.

Das RTCA-System unterscheidet sich von herkömmlichen Endpointassays, da die Messung der Impedanz nicht invasiv ist und qualitativ hochwertige, quantitative Daten zur Zytotoxizität kontinuierlich liefern kann. Wie in Fig.6, es gab signifikante positive korrelationen betweenIC50 werte erhalten mit die RTCA system und WST-8assay, obwohl es waren einige unterschiede in absolute valuesof CI wie niedrigen CI werte erhalten für SQUU-B zell linie. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass selbst ein niedriger CI, der für einige Zelllinien erhalten wurde, in der Lage sein würde, die hohe Empfindlichkeit der Zytotoxizität im RTCAsystem zu bewerten. Während die Echtzeit-IC50-Werte niedriger waren als die Endpunkt-IC50-Werte, wurden die mit dem RTCA-System erhaltenen Echtzeit-ic50-Werte mit den mit dem WST-8-Assay erhaltenen Endpunkt-IC50-Werten verglichen.Diese Ergebnisse legen nahe, dass das RTCA-System verwendet werden kann, um die Wirkung von Antikrebsmitteln auf die Zellproliferation und -adhäsion sensitiv zu bewerten.

Im RTCA-System wirken adhärente Zellen als Isolator auf der Oberfläche der Elektrode und verändern das ionische Medium der Elektrodenlösung, wodurch die Impedanz erhöht wird (27). Somit ist CI eine Funktion der Zellanzahl und des Verhältnisses von Zellen in verschiedenen Zeitintervallen. CI = 0, wennes gibt keine Zelladhäsion (5). CIchanges, die durch RTCA-System beschrieben werden, werden dynamischer Phänotyp von Zellen reflektiert. Diese dynamische Überwachung der Zell-Arzneimittel-Interaktion ermöglicht es uns, ein besseres Verständnis der zeitlichen Wirkungen von Invitro zu erhalten, insbesondere unmittelbar nach der Behandlung mit dem Arzneimittel(28). Das kinetische Merkmal der Zellen bietet aufschlussreiche Informationen, die mit einem herkömmlichen Einzelendpunkt-Assay wie dem WST-8-Assay nicht gewonnen werden können. Während die Ergebnisse des WST-8-Assays die metabolische Reaktion der Überlebenszelle widerspiegeln (29). Toxizität mit WST-8assay könnte unterschätzt werden, wenn Zelle metabolische Reaktion wereremained obwohl dynamische Zelle Reaktion aufgetreten war. Wir schlugen vor, dass diese Unterschiede des Prinzips in zwei Methoden ahuge Unterschiede von IC50 Wert bis zu 8 mal zwischen twomethods induziert wurden, wie in Abb. 6A. Ourprevious Studie berichtet, dass IC50 von imatinib in SQUU-Acells berechnet durch RTCA-System und WST-8 Assay waren 4 µM und 60µM, beziehungsweise (Empfindlichkeit von 15 mal) (6,7). Otherresearch-Gruppen berichteten, dass IC50 von cisplatin in HK-2cells berechnet durch RTCA-System und WST-8 Probe 0.76 µM und 25µM waren, beziehungsweise (Empfindlichkeit von 33mal) (30,31).Diese vorherigen Daten unterstützten unsere Daten, um Gültigkeit zu zeigen.

Es ist wichtig, Messungen von zu erhaltensofort nach der Behandlung mit Antikrebsmitteln, um sowohl die Nebenwirkungen der Mittel als auch ihre gewünschten Wirkungen zu beurteilen. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über nützliche Methoden, die Invitro-Daten mit humanen In-vivo-Daten korrelieren. Wir betrachteten, dassrealzeitmessung unter Verwendung des RTCA-Systems benefitevaluation der Nebenwirkungen von Antikrebsmitteln in normalcells würde.

Zuvor berichtete Cmax-Werte von 5-FU, Doxifluridin, Carboplatin und Docetaxel sind 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), und 2 µM (24,25), beziehungsweise, wenn verwendet, für die intravenöse Behandlung in Menschen. Unsere Daten korrelierten mit den Humandaten, da die Cmax-Werte in den Bereich der in dieser Studie verwendeten experimentellen Dosen einbezogen wurden.RTCA-Systeme sind das neue Hauptgerät zur Bewertung der Zytotoxizität, die die Impedanzintensität der Zelladhäsion und nicht die Enzymaktivität in Zielzellen wie dem MTTassay verwenden. Die vom RTCA-System berechneten IC50-Werte von Antikrebsmitteln korrelierten signifikant mit den ic50-Werten, die mit dem konventionellen Endpunkttest berechnet wurden. Darüber hinaus erhielt das RTCA-System unmittelbar nach der Behandlung mit Antikrebsmitteln automatisch Messungen in Echtzeit.

Tatsächlich kann das RTCA-System nicht direkt bewertenbestimmte Zytotoxizität wie Zelltod oder Apoptose und so weiter, da der Zellindex basierend auf der Impedanz berechnet wurde. Aus diesem Grund könnte der Kombinationstest zwischen RTCA-System und Zelltodmessung eine wirksame Methode sein, um konkrete Zellreaktionen wie Zelltod oder Apoptose genau zu bewerten.Zum Beispiel Annexin-V-Färbung oder Expression von Caspase-3-assayfür den Nachweis von Apoptose, Lactatdehydrogenase (LDH) Release-Assay für den Nachweis von Zelltod könnte wirksame Methoden sein (32,33). Darüber hinaus könnte es nützlich sein, die Expression von Entzündungsprotein in den normalen Zellen für die Erkennung von Nebenwirkungen zu bewerten, wenn Anti-Krebs-Reagenz zu den normalen Zellen hinzugefügt wurde, die auf der E-Platte ausgesät wurden. Dynamische Echtzeitüberwachung während der Zellkultur, einschließlich Antikrebsreagenzien, kann wertvolle Erkenntnisse für die Früherkennung von therapeutischer Effizienz und Nebenwirkung liefern, die mit herkömmlichen Methoden im Endpunkt-Assay nicht bewertet werden können. So, IC50 wert berechnet durch RTCA system könnte beuseful parameter für wie screening von einem standpunkt von echtzeit messung in automatisierten, vermeidung von colorimetricallyproblems oder kontamination. Darüber hinaus ermöglicht das RTCA-System die Analyse des gesamten Versuchszeitraums und erfordert keine Kennzeichnung, die sich negativ auf Zellkulturexperimente auswirken kann.

Die Neuheit dieser Studie ist, dass das RTCA-System eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Zytotoxizität im Vergleich zu einer herkömmlichen Methode, dem WST-8-Assay, nachweisen kann. Darüber hinaus könnte RTCA system evaluateIC50 wert preciously in echtzeit ohne restrictionof experimentelle zeitraum für mindestens 72 h nach zugabe vonanticancer reagenzien.

Zusammenfassend haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass RTCA-Systeme nützlich sind, um die Zytotoxizität zu bestimmen und inzukünftige Entwicklung von Chemotherapeutika mit Krebszellenund Bewertung ihrer Nebenwirkungen in normalen Zellen. Zusätzlich kann ein RTCA-System verwendet werden, um die Zellreaktionsprofile, wie Kombinationstherapie und Antikörper-Zell- oder Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen, von Antikrebsreagenzien zu bewerten.

Ergänzendes Material

Unterstützende Daten

Danksagungen

Nicht zutreffend.

Finanzierung

Es wurde keine Finanzierung erhalten.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der vorliegenden Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind beim entsprechenden Autor auf reasonablerequest erhältlich.

Beiträge der Autoren

MH und MN konzipierten und gestalteten die Studie. MH undTN führten die Experimente durch und erfassten die Daten. MH analysierte die Daten, bereitete die Zahlen vor und entwarf das Manuskript. MH, TKY undMN interpretierten die Ergebnisse. MH und TKY haben das Manuskript bearbeitet und überarbeitet. Alle Autoren haben das Finalmanuskript gelesen und genehmigt.

Ethische Genehmigung und Zustimmung zur Teilnahme

Nicht anwendbar.

Zustimmung des Patienten zur Veröffentlichung