Die präsynaptische Hyperpolarisation induziert eine schnelle analoge Modulation der spike-evozierten Übertragung, die durch axonale Natriumkanäle vermittelt wird

Hyperpolarisationsinduzierte AD-Erleichterung

Wir haben zuerst die Inzidenz einer kurzen Hyperpolarisation der präsynaptischen Zelle bei der synaptischen Übertragung gemessen. Paare von monosynaptisch verbundenen CA3-Neuronen wurden in organotypischen Kulturen des Hippocampus der Ratte nach 8-10 Tagen in vitro aufgezeichnet (DIV)21. Ein hyperpolarisierender 200-ms-Vorimpuls, der vor dem präsynaptischen Spike abgegeben wurde, erhöhte die synaptische Stärke um ∼ 20% (Abb. 1a). Dieser Anstieg wurde beobachtet, wenn entweder die Amplitude oder die Ladung der postsynaptischen Antwort gemessen wurde (Ergänzende Abb. 1). In diesen Experimenten betrug das präsynaptische Ruhepotential -74± 3 mV (n = 10). Der h-ADF war vergleichbar, wenn die präsynaptische Hyperpolarisation -84 oder -102 mV betrug (jeweils 124±8% versus 119±5%, n=10; Wilcoxon-Test P>0.1), was darauf hindeutet, dass eine präsynaptische Hyperpolarisation von ∼ 10 mV ausreicht, um sättigendes h-ADF zu erhalten. h-ADF war mit einem reduzierten Paarpulsverhältnis assoziiert (PPR, von 99±7 auf 88±5%, n=12; Wilcoxon-Test P<0,05; Ergänzende Abb. 1), was darauf hinweist, dass es aus einer präsynaptischen Zunahme der Glutamatfreisetzung resultiert.

Eine 200 ms lange Hyperpolarisation ist in einem physiologischen Kontext unwahrscheinlich. Daher untersuchten wir den zeitlichen Verlauf von h-ADF für kürzere Hyperpolarisationen (15, 50, 100 und 200 ms). h-ADF wurde für alle getesteten Dauer der Hyperpolarisation beobachtet (15 ms: 111±3%, 50 ms: 116±4%, 100 ms: 109±4%, 200 ms: 120±6% Wilcoxon, P<0,05 für alle Dauer, n= 7, Abb. 1b). Nach diesem Ergebnis wird h-ADF wahrscheinlich durch physiologische Hyperpolarisation induziert.

CA3-Pyramidenneuronen exprimieren depolarisationsinduzierte AD-Facilitation (d-ADF), die sich aus der langsamen Inaktivierung von Kv1.1-Kanälen ergibt (Zeitkonstante: 3,3 s)13. Wir untersuchten daher, ob sowohl d- als auch h–ADF an den gleichen CA3-CA3-Verbindungen exprimiert wurden. Präsynaptische APs wurden wahlweise aus Ruhemembranpotential (-78 mV-Steuerung), nach einer langen Subschwellen-Depolarisation (10 s, -62,6 mV, d-ADF), nach einer kurzen Hyperpolarisation (200 ms, -96,1 mV, h-ADF) oder nach der Kombination einer langen Depolarisation und einer kurzen Hyperpolarisation (d- und h-ADF; Fig. 1c, links). Tatsächlich führte die Kombination der beiden Formen von ADF bei denselben Verbindungen zu einer größeren Erleichterung (113 ± 3%, n = 16; Abb. 1c) als die von jedem Protokoll separat erzeugte (d-ADF allein: 105±3%, n= 16, h-ADF allein: 108±4%, n= 11; Abb. 1c). Insbesondere wurde festgestellt, dass gemittelte h- und d-ADF linear summieren, was auf zwei unabhängige molekulare Mechanismen hindeutet. Darüber hinaus wurden d- und h-ADF, die in den gleichen Paaren gemessen wurden, positiv korreliert (Ergänzende Fig. 1), was darauf hindeutet, dass einige synaptische Verbindungen anfälliger für AD-Erleichterung sind, wahrscheinlich weil die analoge Signalausbreitung entlang des Axons vom Abstand zwischen dem Soma und den präsynaptischen Terminals abhängt. Diese Daten zeigen, dass h- und d-ADF in CA3-Pyramidenneuronen koexistieren und dass die zugrunde liegenden Mechanismen wahrscheinlich unabhängig sind.

h-ADF wurde in jungen CA3–Neuronen (DIV8–10, hergestellt aus P5-P7-Ratten) beobachtet und könnte daher hauptsächlich auf die geringe Dichte oder die unreifen Eigenschaften spannungsgesteuerter Ionenkanäle zurückzuführen sein. Wir haben daher festgestellt, ob h-ADF auch in reifen CA3-Pyramidenzellen gefunden wurde. Gepaarte Aufnahmen von verbundenen CA3-Neuronen wurden in DIV24–DIV32-Schnittkulturen erhalten. Eine kurze präsynaptische Hyperpolarisation (200 ms) erhöhte die synaptische Stärke signifikant (104.2±1,1% n=25; Wilcoxon, P<0,01; Ergänzende Abb. 2). die in reifen Zellen gemessene h-ADF war kleiner als die in sich entwickelnden Neuronen gemessene (Mann-Whitney, P<0,01; Ergänzende Abb. 2). Wir schließen daher, dass h-ADF in vitro in CA3-Neuronen entwicklungsreguliert ist.

Alle Aufnahmen wurden mit hohem extrazellulärem Calcium (3 mM) erhalten, um die synaptische Stärke zu optimieren. Unter diesen Bedingungen ist die präsynaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit hoch und präsynaptische Erleichterungen wie h-ADF könnten unterschätzt werden. Wir haben daher h-ADF in reifen CA3–Neuronen (DIV24-DIV32) gemessen, die mit physiologischem extrazellulärem Calcium (1,3 mM) aufgezeichnet wurden22. Unter diesen Bedingungen wurde h-ADF um +16,4% gefunden (Wilcoxon, P<0,01; Ergänzende Abb. 2). Wir schließen daraus, dass h-ADF in reifen Neuronen, die in physiologischem extrazellulärem Kalzium aufgezeichnet sind, robust exprimiert wird.

h-ADF wird durch simulierte IPSPs und Oszillationen induziert

Um die Rolle von h-ADF unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurde eine GABAA-ähnliche Leitfähigkeit in das präsynaptische Neuron mit Dynamic Clamp eingeführt (Abb. 2a, links). In Übereinstimmung mit den in Fig. 1, APs, dem die Injektion eines IPSC-ähnlichen Stroms vorausging, erzeugte eine größere Reaktion im postsynaptischen Neuron im Vergleich zu APs, die vom Ruhemembranpotential ausgelöst wurden (Wilcoxon P<0.001, n=11). In Übereinstimmung mit einer präsynaptischen Erhöhung der Glutamatfreisetzung wurde die PPR reduziert, wenn simulierte gabaerge IPSPs APs vorausgingen (von 121% in der Kontrolle auf 96%; Wilcoxon P<0,05, n = 7; Daten nicht gezeigt). Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Größe der synaptischen Potenzierung von der Größe des simulierten IPSP abhängt (R2 = 0,39, P<0,05), was darauf hinweist, dass h-ADF zwischen Ruhemembranpotential (-74 mV) und 10-mV-Hyperpolarisation (-84 mV; Abb. 2a, rechts). Tatsächlich wurde festgestellt, dass der Erleichterungsfaktor in diesem Bereich 1,8% pro mV Hyperpolarisation betrug.

Als nächstes untersuchten wir die Modulation der synaptischen Stärke während der präsynaptischen Membranpotentialschwingung. Die Schwingung des präsynaptischen Membranpotentials bei 4 Hz wurde durch Einspritzen von sinusförmigem Strom erzeugt, und einzelne präsynaptische Spitzen wurden in verschiedenen Phasen der Schwingung hervorgerufen. In Übereinstimmung mit den vorherigen Ergebnissen wurde h-ADF beobachtet, wenn die Zelle während hyperpolarisierender Phasen der Oszillation feuerte (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon P<0,05, n=8; Abb. 2b). In anderen Phasen ist die synaptische Stärke unverändert (56 ms: 112,2±6%, 163 ms: 95,8±5%, 211 ms: 110,5±6%, Wilcoxon P>0,1, n=8). Insbesondere wird bei der Depolarisation kein d-ADF beobachtet, da seine Dauer zu kurz ist, um Kv1.1-Kanäle zu inaktivieren13. Wir schließen daraus, dass Oszillationen im θ-Bereich h-ADF in CA3-Neuronen induzieren.

h-ADF ist mit einer Zunahme der axonalen Spike-Amplitude assoziiert

Als nächstes untersuchten wir die Mechanismen, die h-ADF zugrunde liegen. Ein möglicher Mechanismus für h-ADF ist eine durch die Hyperpolarisation induzierte Modulation der präsynaptischen Spike-Amplitude. Wir untersuchten daher die Konsequenz der Hyperpolarisation auf die im Axon gemessene Spike-Amplitude. CA3-Neuronen wurden mit Alexa 488 (50 µM) gefüllt, um die Axon-Arborisierung zu visualisieren, und zellgebundene Aufnahmen wurden vom Axon in Abständen zwischen 60 und 240 µm erhalten (Abb. 3a). Bei somatischer Hyperpolarisation wurde die Amplitude des axonalen Spike verstärkt (106±1% der Kontrollamplitude, n= 6, Wilcoxon, P<0,05; Abb. 3b). Es wurde jedoch festgestellt, dass die Größe der axonalen Spike-Erleichterung mit dem axonalen Abstand mit einer Raumkonstante von 212 µm abnimmt (Abb. 3b). Zusammenfassend ist h-ADF in CA3-Neuronen mit einem lokalen Anstieg der Spike-Amplitude im Axon verbunden.

Während die Ganzzellaufzeichnung von CA3-Axonen in organotypischen Kulturen äußerst schwierig ist, kann sie in L5-Pyramidenneuronen aus akuten Scheiben erhalten werden5,6. Daher haben wir zunächst gemessen, ob h-ADF auch an L5–L5 exzitatorischen Verbindungen beobachtet werden kann. Paare von monosynaptisch verbundenen L5-Pyramidenneuronen wurden in akuten Schnitten aus dem sensomotorischen Kortex junger Ratten aufgezeichnet (P14–P20). Es wurde festgestellt, dass eine kurze Hyperpolarisation im Soma (200 ms, 10-15 mV) des präsynaptischen Neurons die synaptische Stärke erhöht (109,6 ± 2,3%, n = 13, Wilcoxon-Test, P<0,05; Abb. 4a).

Um zu bestätigen, dass h-ADF in L5-Pyramidenneuronen mit einer Zunahme der axonalen Spike-Amplitude assoziiert war, wurden simultane Ganzzellaufnahmen aus dem Soma und Cut-End-Axonen (Blebs) (50-80 µm aus dem Soma) in L5-Pyramidenneuronen erhalten. Transiente Hyperpolarisation des Somas (ungefähr -13 mV) verstärkte die Amplitude des Spike-Überschwingens im Axon, aber nicht im Soma (+5,5 ±1,5 versus -0,3±1,1 mV, n=5, Mann-Whitney, P<0,05; Abb. 4b). Die Depolarisationsgeschwindigkeit wurde ebenfalls erhöht (von 251 ± 59 auf 289 ± 56 mV ms−1, n = 5) und die Spike-Schwelle wurde hyperpolarisiert (von -35,7 ± 5,2 auf -38,8 ± 4,3 mV, n = 5). Wir schließen daraus, dass h-ADF sowohl in CA3- als auch in L5-Pyramidenzellen mit der Zunahme der im Axon gemessenen Spike-Amplitude assoziiert ist.

h-ADF ist mit verstärkten axonalen Calciumsignalen assoziiert

Als nächstes verwendeten wir die Ca2 + -Bildgebung, um die Konsequenz einer hyperpolarisationsinduzierten Verstärkung der Spike-Amplitude im Axon zu bestimmen. CA3 Pyramidenneuronen wurden mit 50µM Alexa-594 gefüllt; 250 µM Fluo-4 und Spike-evozierte Calciumsignale wurden in mutmaßlichen en passant Boutons in Abständen zwischen 150 und 250 µm vom Soma gemessen (Abb. 5a). Das Integral des Spike-evozierten Ca2+ Transienten wurde erhöht, wenn der präsynaptische Spike nach einer transienten Hyperpolarisation von ∼20 mV evoziert wurde (126±10%, n=5; Abb. 5b). Wir schließen daraus, dass während der h-ADF die präsynaptische Hyperpolarisation sowohl die präsynaptische Spike-Amplitude als auch den Spike-induzierten Ca2 + -Zustrom verstärkt, was anschließend die Glutamatfreisetzung erhöht.

Nav-Kanal-Inaktivierung im Axon bestimmt h-ADF

Die erhöhte Amplitude der axonalen Spitze während der Hyperpolarisation könnte auf die Wiederherstellung von Nav-Kanälen nach Inaktivierung zurückzuführen sein. Um die Rolle der Natriumkanalinaktivierung in h-ADF zu bestätigen, verwendeten wir ein Neuronenmodell von zwei monosynaptisch verbundenen CA3-Neuronen. Wir haben dann die Inzidenz der Inaktivierung von Natriumkanälen im Axon auf h-ADF bestimmt. Wenn die Halbinaktivierung der axonalen Natriumkanäle auf -80 mV eingestellt wurde (refs 18, 19), verstärkte die somatische Hyperpolarisation die Spike-Amplitude, die Ladung des Spike-evozierten Calciumstroms und die synaptische Übertragung (Abb. 6a, links). Dies ist auf die Wiederherstellung von Nav-Kanälen aus der Inaktivierung durch Hyperpolarisation zurückzuführen (Abb. 6b, links). Keine Änderung trat jedoch ein, wenn die Halbinaktivierung der axonalen Natriumkanäle auf -70 mV eingestellt wurde (Fig. 6a, rechts). In diesem letzteren Fall ist der Anteil der verfügbaren Nav-Kanäle bereits bei ruhendem Membranpotential sehr hoch, wodurch ein AP mit voller Amplitude erzeugt wird (Fig. 6a, b, rechts). Daher beeinflusst die Erholung von der Inaktivierung die präsynaptische Spike-Amplitude nicht weiter. Somit ist h-ADF im Modell auf die Wiederherstellung von Nav-Kanälen aus der Inaktivierung zurückzuführen und wird durch Hyperpolarisierung der Nav-Halbinaktivierung erhöht (Abb. 6c).

Darüber hinaus haben wir unser Neuronenmodell verwendet, um die Verfügbarkeit axonaler Nav-Kanäle während einer Theta-Oszillation ähnlich der in Abb. 2b. Es wurde festgestellt, dass Nav-Kanäle während der Depolarisation inaktivieren und sich während der Hyperpolarisation erholen, was die EPSC-Modulation während der Oszillation erklärt (Ergänzende Fig. 4). Die Inaktivierung ist jedoch aufgrund der langsameren Nav-Kinetik bei depolarisierten Potentialen schneller als die Erholung während der Oszillation (Ergänzende Abb. 4). Dies erklärt, warum die bei 163 ms erzeugten EPSCs keine h-ADF zeigten, obwohl der Spike von einem leicht hyperpolarisierten Potential emittiert wird (Abb. 2b). Tatsächlich hatten die Kanäle zu diesem Zeitpunkt der Schwingung nicht genug Zeit, um sich von der Inaktivierung zu erholen (siehe Abb. 4).

Insgesamt stützen diese Ergebnisse die Tatsache, dass h-ADF auf die Wiederherstellung von Nav-Kanälen nach Inaktivierung zurückzuführen ist.

Natriumkanaldichte bestimmt die Stärke von h-ADF

h-ADF hängt von der Verfügbarkeit von Natriumkanälen im Axon ab. Daher sollte die Verringerung der Dichte von Nav-Kanälen h-ADF beeinflussen. Tatsächlich zeigte unser Modell, dass die Reduzierung der Nav-Kanaldichte auf 70% der Kontrollbedingung die h-ADF von 130 auf 180% verbesserte (Abb. 7a). Der kritische Parameter war hier die Verstärkung des präsynaptischen Spike-Überschwingens, die von der aktivierbaren Na-Leitfähigkeit abhängt (Abb. 7b). Unter Kontrollbedingungen war dieser Wert bereits hoch, und die Hyperpolarisierung des präsynaptischen Elements von -78 auf -93 mV erhöhte die Amplitude des Spike um 28%. Wenn die Dichte von Nav reduziert wurde, erhöhte dieselbe Hyperpolarisation die Amplitude des präsynaptischen AP um 42%.

Als nächstes verifizierten wir experimentell, dass die Verringerung der Nav-Kanaldichte die h-ADF in CA3-Neuronen erhöhte. Wir blockierten daher teilweise Nav-Kanäle mit einer niedrigen Konzentration von Tetrodotoxin (TTX) im Bad (15-25 nM). Bei dieser Konzentration blockiert TTX ∼80% des Na + -Stroms, bewahrt jedoch die Induktion schneller Na + -Spikes24,25. In Gegenwart von TTX war die Spike–Amplitude im Soma um 45±4% (n= 9) und die synaptische Transmission an CA3-CA3-Verbindungen um 55±8% reduziert (n= 9; Ergänzende Abb. 5). Am wichtigsten ist, dass die Verringerung des Anteils aktivierbarer Nav-Kanäle mit 15-25 nM TTX h-ADF in reifen Neuronen, die kein h-ADF exprimieren, stark verbessert (von 103 ± 3% in der Kontrolle auf 121 ± 4% in Gegenwart von TTX, n = 6, Wilcoxon P< 0,05; Abb. 7c, d). Diese Daten bestätigen daher, dass h-ADF in CA3-Neuronen von der Verfügbarkeit von Nav-Kanälen abhängt.

Im Axon sind Ca2+-Kanäle vom T-Typ vorhanden. Sie könnten während der Hyperpolarisations–Depolarisations-Sequenz aktiviert werden, die verwendet wird, um h-ADF zu induzieren, und können somit h-ADF erklären. Es wurde jedoch festgestellt, dass h-ADF in Gegenwart von 100 nM Mibefradil, einem T-Typ-Kanalblocker, stabil bleibt (von 112,2 ± 1,1% unter Kontrolle bis 116,2 ± 11,9% mit Mibefradil, n = 3; Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass T-Typ-Ca2 + -Kanäle nicht an h-ADF teilnehmen.

h-ADF fördert die Netzwerksynchronität

Als nächstes testeten wir die Implikation von h-ADF in der Netzwerksynchronität unter Verwendung eines Hippocampus-Netzwerkmodells, das aus 80 pyramidenartigen exzitatorischen Zellen (e-Zellen) und 20 interneuronartigen inhibitorischen Zellen (i-Zellen) besteht, die miteinander verbunden sind (Abb. 8a; siehe Methoden). e- und i-Zellen wurden durch stochastische Eingabe gespeist. Das Netzwerk der E-Zellen wurde synchronisiert, und Schwingungen im Gammabereich traten auf, als die synaptische Stärke zwischen den E-Zellen zunahm (ergänzende Abb. 6). Diese Schwingungen wurden von i-Zellen angetrieben: Die Aktivierung von e-Zellen förderte die Aktivierung von i-Zellen, was wiederum das gesamte Netzwerk zum Schweigen brachte (Ergänzende Abb. 6). Da h-ADF die interpyramidale synaptische Stärke erhöht, wenn dem präsynaptischen Spike ein IPSP vorausgeht, ist h-ADF ein guter Kandidat, um diese i-Zell-getriebenen Oszillationen zu fördern.

Die h-ADF-Regel wurde in das Netzwerk integriert, indem die synaptische Stärke zwischen e-Zellen entsprechend dem 17 ms vor dem Spike gemessenen Membranpotential erhöht wurde. Tatsächlich wurde die synaptische Stärke um 20% erhöht, wenn das präsynaptische Potential unter -84 mV lag (Abb. 8b). Diese Regel wurde direkt aus experimentell gemessenen Werten abgeleitet (siehe Figuren 1a und 2a). Für eine E-Zell-synaptische Stärke von 2,8 mS verbesserte die Zugabe von h-ADF im Netzwerk sowohl die Zündfrequenz als auch die Synchronität über e-Zellen hinweg deutlich (Abb. 8c-e). Tatsächlich wurde die Neigung, im Gammabereich zu oszillieren, erheblich erleichtert, wenn h-ADF zwischen e-Zellen wirksam war (Abb. 8e). Interessanterweise verbesserte die h-ADF-Regel in einem Netzwerk mit Rangierhemmung (ECl = -73 mV anstelle von -80 mV im Kontrollzustand) die Synchronität nicht und förderte keine Gammaschwingungen (Ergänzende Abb. 6). Da h-ADF jedoch die synaptische Stärke zwischen e-Zellen erhöht, könnte seine synchronisierende Wirkung einfach auf die Zunahme der Spike-Rate des Netzwerks zurückzuführen sein. Um die Spike-Rate zu erhöhen, ohne die synaptische Stärke zu beeinflussen, haben wir beschlossen, die Inter-E-Zell-Stärke auf 2,5 mS zu fixieren und die externe Antriebsfrequenz von E-Zellen von 6 auf 20 Hz zu erhöhen. Wir haben den Synchronisationskoeffizienten gegen die Spitzenrate des Netzwerks aufgetragen. Selbst wenn die Synchronität linear mit der Spike-Rate korrelierte, erhöhte h-ADF den Synchronisationskoeffizienten für jede gegebene Spike-Rate im 4-14-Hz-Bereich (Ergänzende Abb. 6). Dies zeigte, dass h-ADF bei niedriger Spike-Rate die Synchronität unabhängig von der mittleren Netzwerkaktivität erhöht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass h-ADF in unserem Modell die Netzwerksynchronisation erhöht und Oszillationen fördert, indem es die interpyramidale synaptische Stärke mit der Aktivität von Interneuronen verbindet.