Um die Leistung der gezielten Homing-Endonukleasen zu nutzen, arbeitete das Jerome-Labor daran, ein nützliches Verabreichungssystem sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Studien zu optimieren. Sie verwendeten ein adeno-assoziiertes Virus (AAV) -Abgabesystem, um Maus-Trigeminusganglien mit einer von zwei HSV-spezifischen Endonukleasen anzugreifen: HSV1m5, das zur Spaltung des Virionprotein-VP5-Gens bestimmt ist, und HS1m8 , das auf das Gen abzielt, das für die katalytische Untereinheit der DNA-Polymerase kodiert. Das Erzeugen von Mutationen in einem dieser Gene führt zu einer Störung des viralen Genoms und verhindert die Virionproduktion. Um die Wirkungen der Behandlung Trex-2 weiter zu verstärken, wurde eine 3′-5′-Endonuklease, die nachweislich die gerichtete Mutagenese erhöht, co-transduziert. Nach der Etablierung des Systems begann das Labor mit In-vitro-Arbeiten, die sich auf Neuronen, den biologisch relevanten Zelltyp, konzentrierten. Kulturen von Neuronen wurden mit HSV1m5 oder 8 und Trex-2 co-transduziert und dann mit HSV infiziert. Behandelte Kulturen zeigten eine 50% ige Reduktion des Virustiters sowie das Vorhandensein von Mutationen im HSV durch den T7-Endonuklease-1-Assay und die klonale Sequenzierung. Sobald die Störung der lytischen Infektion festgestellt wurde, begannen die Forscher, die Auswirkungen auf die verschiedenen Stadien der HSV-Infektion zu untersuchen. Mit infizierten Kulturen von Neuronen mit HSV und anschließender Behandlung mit HSV1m5 oder 8 mit Trex-2 zu verschiedenen Zeitpunkten konnten die Forscher die verschiedenen Stadien der Infektion simulieren. Sie behandelten Kulturen nach 7 Tagen (akute Phase), 14 Tagen (späte akute / frühe latente Phase) und 32 Tagen (latente Phase) und fanden unabhängig von der Virusphase keine Veränderung der Wirkung. Dies deutet darauf hin, dass HSV unabhängig von der Virusphase ähnlich anfällig für Endonuklease-Mutagenese ist. Die Konzentrationen der Zielstellenmutationen reichten von 4,5-7,6% und 1,1-6,6% für HSV1m5 und HSV1m8. Derzeit ist dies die erste Studie, die sich mit der Endonukleaseaktivität in latent infizierten Neuronen befasst.Ermutigt durch die In-vitro-Ergebnisse führten die Forscher In-vivo-Studien mit HSV-infizierten Mäusen durch, gefolgt von einer AAV-Injektion (Expression von HSV1m5 oder 8 und Trex-2) 32 Tage später. Neuronen aus den Mäusen wurden 30 Tage nach AAV-Injektion auf Virentiter, Viruslast und HSV-Genommutationen untersucht. Die Gruppe zeigte 1-2% Mutationen in 2/4 Mäusen für HSV1m5 und in 3/4 Mäusen für HSV1m8. Die Viruslast dieser Tiere war jedoch zwischen Kontroll- und behandelten Tieren ähnlich. Die Virusausscheidung verzögerte sich bei behandelten Tieren um einen Tag, erreichte aber im Laufe der Zeit ähnliche Werte wie bei unbehandelten Tieren. Nach dem Nachdenken über die Ergebnisse sagte Dr. Jerome: „Dies ist das erste Mal, dass eine tatsächliche latente Virusinfektion bei einem Tier festgestellt und dann unter Verwendung der Endonuklease-Therapie sogar teilweise deaktiviert wurde. Es stellt also einen entscheidenden Schritt dar, um solche Therapien für die menschliche Anwendung zu bringen. Die größte Herausforderung besteht nun darin, die Wirksamkeit der Therapie zu erhöhen, so dass das latente Virus vollständig oder fast vollständig genetisch deaktiviert ist. Wir untersuchen neuere, effizientere Nukleasen wie CRISPR / Cas und evaluieren neue Methoden zur Abgabe der Nukleasen an infizierte Neuronen in vivo.“ In Zukunft könnte diese Therapie zu einer neuen Denkweise über die Behandlung latenter Krankheiten wie HSV und HIV führen, die wir derzeit als unheilbar betrachten.Die Finanzierung dieser Forschung wurde von den National Institutes of Health und der Canadian Foundation zur Verfügung gestellt.
Aubert M,Madden EA,Loprieno M,DeSilva Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret A, Galleto R,Stein D,Jerome KR. 2016. In vivo Störung des latenten HSV durch Designer-Endonuklease-Therapie. JCI Einblick, 1(14).