emner
enogtredive sunde, modstandstrænede mænd (22,1 kr.5,0 år, 180 kr. 0,1 cm, 86,1 kr. 13,0 kg, 18,1 kr. 6,4% kropsfedt) blev informeret om studieprotokol godkendt af det institutionelle Gennemgangsudvalg på Baylor University inden deltagelse. Træningsstatus blev selvrapporteret, og personer, der manglede mindst et års erfaring inden studiet, blev ekskluderet. Derudover blev forsøgspersoner udelukket, hvis de: 1) havde nogen historie med metabolisk, hypertension, hepatorenal, muskuloskeletal, autoimmun eller neurologisk sygdom; 2) tog i øjeblikket skjoldbruskkirtel, antihyperlipidæmisk, hypoglykæmisk, antihypertensiv eller androgen medicin; og 3) havde taget kosttilskud, der kan påvirke muskelmasse og/eller anabolske/kataboliske hormonniveauer inden for tre måneder efter starten af undersøgelsen.
Baseline test
kvalificerede forsøgspersoner blev bekendt med undersøgelsesprotokollen via en verbal og skriftlig forklaring af undersøgelsesdesignet. Emner underskrev en informeret samtykkeerklæring og afsluttede personlige og medicinske historier, mens de også afsluttede en anaerob kapacitetstest før baseline-test. Forsøgspersonerne blev instrueret i at afstå fra anstrengende træning i 48 timer og faste i 10 timer før baseline-test (dvs.dag 0), der fandt sted 3-4 dage efter fortrolighed for at muliggøre registrering af diætindtagelse. Denne undersøgelse anvendte et dobbeltblindt, placebokontrolleret, parallelt studiedesign, hvor forsøgspersoner blev matchet jævnt i klynger efter alder og kropsmasse.
eksperimentel protokol
i løbet af dag 0, 25 og 50 rapporterede hvert individ til laboratoriet efter en 10-timers hurtig. Højden blev målt ved hjælp af standardantropometri, og den samlede kropsmasse blev målt ved hjælp af en kalibreret Healthometer digital strain gauge elektronisk skala (Brovisning, IL) med en præcision på 0,02 kg. Kropssammensætning blev derefter bestemt ved hjælp af en kalibreret Holologisk opdagelse med dobbelt energi røntgenabsorptiometer (Dksa) enhed (Hologic Inc., Bedford, MA), mens blodtryk og hvilepuls blev bestemt ved hjælp af standardprocedurer. 25 ml fastende blod ved hjælp af standard venepunkturteknikker til hæmatologiske, kliniske kemipaneler og senere cytokin-og hormonanalyse. To 10 ml serum separation vacutainer rør og et 5 ml K3 EDTA vacutainer rør blev indsat i vacutainer holderen til blodopsamling i rækkefølge ved hjælp af flere prøve phlebotomy teknikker. Fuldblod blev straks analyseret for et fuldstændigt blodtal, mens serumvacutainer-rør blev centrifugeret ved stuetemperatur i 15 minutter ved 1.500 g, serumsupernatanten blev overført til mikrocentrifugerør, og serumprøverne blev opbevaret ved -20 liter C til efterfølgende hormon-og metabolitanalyser. Kun på dag 0 og 50 donerede forsøgspersoner cirka 60 mg skeletmuskulatur fra vastus lateralis ved hjælp af Bergstrom biopsi teknik. Øvre og nedre kropsstyrke blev vurderet ved hjælp af standard 1RM testprocedurer med en bænkpress og 35 liter hofteslæde maskine (Nebula, Versailles, OH). Test-retest pålidelighed af disse styrketest på modstandstrænede emner i vores laboratorium har givet en høj pålidelighed for bænkpressen (r = 0,94) og benpressen (r = 0,91). Efter bestemmelse af hofteslæde 1RM hvilede forsøgspersoner 10 minutter, før de gennemførte en 30 sekunders anaerob kapacitetstest på et computeriseret cyklusergometer (Lode Eksalibur, Lode, Groningen, Holland) for at vurdere anaerob effekt i underkroppen. Denne test bestod i at have hvert motiv sprint på en helt ude måde på cykel ergometer i 30 sekunder mod en standard arbejdsbyrde på 0,075 kg·kg-1 kropsvægt. Test-retest pålidelighed for absolut spidseffekt og gennemsnitlig effekt i vores laboratorium har også givet høje pålidelighedsværdier (r = 0,69 og r = 0.95 henholdsvis P < 0.05).
perkutane muskelbiopsier
muskelbiopsier blev taget på dag 0 og 50 før al styrketest for at undgå potentiel myofibrillar forstyrrelse på grund af træning . Emner blev instrueret om at afstå fra træning 48 timer før hver muskelbiopsi. Muskel blev ekstraheret fra den laterale del af vastus lateralis midtvejs mellem patella og iliac crest af det dominerende ben ved hjælp af en 5 mm biopsi nål med påført sugning . Kort sagt 1,5 ml 1.0% Lidocaine HCl blev injiceret subkutant inden der blev foretaget et lille pilotinsnit. Ved hjælp af dobbelthakkeprocedurer og anvendt sugning havde prøven først fjernet alt synligt fedt og bindevæv, inden det blev frosset i flydende nitrogen. Alle prøver blev efterfølgende opbevaret ved -80 kr. C indtil senere analyser.
Suppleringsprotokol og diætovervågning
på en dobbeltblind måde indtog forsøgspersoner fire 250 mg kapsler indeholdende en majsolie placebo eller AA (h-faktor, Molekylær Ernæring, Jupiter, FL) over 50 dage efter baseline-test. Kosttilskud blev fremstillet i kapselform og pakket i generiske flasker ved Molekylær Ernæring. Overholdelse blev overvåget ved at få forsøgspersoner til at returnere tomme suppleringsflasker efter 25 og 50 dages tilskud. I overensstemmelse med tidligere retningslinjer og i et forsøg på at sikre, at energi-og proteinindtag var tilstrækkeligt til at lette muskelhypertrofi, blev alle forsøgspersoner instrueret i at øge kaloriindtaget med cirka 500 kcal·Dag-1, samtidig med at der opretholdes et estimeret proteinindtag på 2 g·kg-1·dag-1 sammenlignet med baseline diætanalyse . 290 kilokalorier, 24 g kulhydrat, 45 g protein og 1 g fedt pr.portion i et forsøg på at imødekomme ovennævnte energi-og proteinbehov. Afhængigt af baseline proteinindtag blev forsøgspersoner bedt om at indtage 1 til 2 pakker af måltidserstatningstilskuddet om morgenen og/eller umiddelbart efter hver træning . Derudover blev forsøgspersonerne instrueret i at undgå regelmæssigt forbrug af fødevarer, der vides at være højt i kur-3 fedtsyrer, herunder fiskeolie, hørfrøolie, koldtvandsfisk, olivenolie, sesamolie, jordnøddesmør, N-acetyl-cystein, konjugeret linolsyre samt antiinflammatoriske lægemidler, herunder acetaminophen, ibuprofen, aspirin og andre ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler . Diætindtagelse såvel som linolsyre (18:2, Kurt-6), linolensyre (18:3, Kurt-3) og AA-indtag blev overvåget med 4-dages diætindkaldelser på dag 0, 25 og 50 og vurderet ved hjælp af fødevareprocessor III ernæringsprogram (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Resistance-training protocol
over en 50-dages periode afsluttede forsøgspersoner et 4-dages·uge-1 split-body, lineært periodiseringsmodstandstræningsprogram. Overkropslifte inkluderet bænkpress, lat træk, skulderpresse, siddende rækker, skulder trækker på skuldrene, brystfluer, biceps krøller, og triceps Tryk-nedture, mens underkropsløftninger inkluderede benpresse, rygforlængelse, trin ups, benkrøller, benforlængelse, hæl hæver, og abdominal crunches to gange om ugen. Emner udførte 3 sæt med 10 gentagelser med så meget vægt som de kunne løfte pr.sæt (dvs. 60-80% af 1RM). Hvileperioder mellem øvelser oversteg ikke 3 minutter, mens resten mellem sæt ikke oversteg 2 minutter. Uddannelsen blev gennemført på universitetets student life center, dokumenteret i træningslogfiler og underskrevet af udpegede medarbejdere for at verificere overholdelse og overvåge fremskridt. Denne protokol er blevet vist i tidligere forskning for at fremme betydelige gevinster i muskelstyrke, muskulær udholdenhed og fedtfri masse .
Serum-og fuldblodanalyser
Serum-og fuldblodsprøver blev brugt til at evaluere klinisk sikkerhed under suppleringsprotokollerne. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Komplette blodlegemer inklusive antal røde blodlegemer, hæmoglobin, hæmatokrit, gennemsnitlig cellevolumen, gennemsnitlig corpuskulært hæmoglobin, gennemsnitlig corpuskulær hæmoglobinkoncentration, rødcellefordelingsbredde, antal hvide blodlegemer, neutrofiler, lymfocytter, monocytter, eosinofiler og basofiler blev analyseret via strømningscytometri ved hjælp af celle-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test for at teste pålideligheden (inden for og Mellem) af udførelsen af disse assays varierede fra 2 til 6% for individuelle assays med en gennemsnitlig variationskoefficient (C V ) på 3,0%. Prøver blev kørt i to eksemplarer for at verificere resultaterne, hvis de observerede værdier var uden for kontrolværdier og/eller kliniske normer i henhold til standardprocedurer.efterfølgende serumprøver blev senere analyseret for cortisol (CORT), frit testosteron (fTEST), total testosteron (tTEST), interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E2 (PGE2) og prostaglandin F2a (PGF2a). Immunabsorbentassays blev anvendt til at analysere serumkoncentrationer af PGF2a, PGE2 og IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) og CORT, fTEST og tTEST (Diagnostic Systems Laboratories). C V for at udføre disse VVM-baserede analyser varierede fra 3,0 til 5,0%.
Total RNA-isolering
Total cellulært RNA blev ekstraheret fra homogenatet af biopsiprøver med en monofasisk opløsning af phenol og guanidinisothiocyanat indeholdt i TRI-reagenset (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). De samlede RNA-koncentrationer fra hver prøve blev bestemt spektrofotometrisk med en optisk densitet på 260 nm (OD260), med den endelige koncentration justeret til 200 ng·liter-1 ved fortynding af de rå totale RNA-ekstrakter til DEPC-behandlet nuklease-fri H2O. Denne procedure har vist sig at give ikke-nedbrudt RNA, fri for DNA og proteiner som indikeret af fremtrædende 28S og 18S ribosomale RNA-bånd såvel som et OD260/OD280-forhold på cirka 2,0 . RNA-prøverne blev opbevaret ved -80 kr. C indtil senere analyser.
revers transkription og klonal DNA-syntese
de standardiserede opløsninger af totalt cellulært RNA blev revers transkriberet for at syntetisere klonalt DNA (cDNA) som beskrevet tidligere . Kort sagt blev en revers transkriptionsreaktionsblanding inkuberet ved 42 liter C i 40 minutter, opvarmet til 85 liter C i 5 minutter og derefter hurtigkølet på is, hvilket gav cDNA-produktet. Start af cDNA-skabelonkoncentrationer blev standardiseret til 200 ng·liter-1 Før realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR) amplifikation ved at detektere rå cDNA-syntetiserede produkter spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 260 nm og fortynde dem i nuklease-fri H2O. de standardiserede cDNA-opløsninger blev frosset ved -80 liter C, indtil RT-PCR i realtid blev udført.
RT-PCR
anti-sense og sense oligonukleotid primer par blev konstrueret ved hjælp af kommercielt tilgængelige Beacon Designer program (Bio-Rad, Hercules, CA) fra kendte mRNA-sekvenser offentliggjort i GenBank Nucleotid database og kommercielt syntetiseret (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Følgende 5′ sense og 3 ‘anti-sense oligonukleotidprimere blev brugt til at isolere de tre voksne MHC-isoformer( Type i, IIa og Iiks): Type i MHC mRNA (5 ‘primer: baser 776-796, 3′ primer: baser 1398-1378, GenEMBL AC 06976), Type IIa MHC mRNA (5’ primer: baser 776-796, 3 ‘primer: baser 1398-1378, GenEMBL AC 06976), Type IIa MHC mRNA (5’ primer: baser 1785-1805, 3 ‘primer: baser 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), type Iiks MHC mRNA (5′ primer: baser 1138-1158, 3’ primer: baser 1746-1726, GenEMBL AC af111785). Disse primere forstærker fragmenter af henholdsvis 141, 145 og 148 basepar for type i, IIa, Iiks MHC. som en ekstern referencestandard til påvisning af relativ ændring i mængden af mål-mRNA på grund af dets overvejelse som et konstitutivt udtrykt husholdnings-gen forstærker disse prior-actinprimere et PCR-fragment på 135 basepar. To hundrede ng af cDNA blev tilsat til hver af de fire PCR-reaktioner for MHC type i,- IIa og-Iiks og larr-actin. Specifikt indeholdt hver PCR-reaktion følgende blandinger: 2 liter cDNA-skabelon blev tilsat sammen med 12,5 liter 2 liter SYBR-grøn Superblanding (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 liter sense-og anti-sense-primere og 7,5 liter-nuklease-fri dH2O]. Hver PCR-reaktion blev amplificeret med en termisk cycler (Bio Rad, Hercules, CA), og amplifikationssekvensen involverede et denatureringstrin ved 95 liter C i 30 sekunder, primerglødning ved 55 liter C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 liter C i 60 sekunder . RT-PCR blev udført over 40 cyklusser med udsendt fluorescens fra SYBR grøn fluorofor måles efter hver cyklus. En emission af fluorescens opstår på grund af integrationen af SYBR green i det dobbeltstrengede cDNA produceret under PCR-reaktionen. Alle CT-værdier blev vurderet i den lineære del af amplifikationen, og en DNA-smeltekurveanalyse blev udført efter amplifikation for at sikre, at de enkelte genprodukter blev amplificeret i fravær af primerdimerer. Kvantificering af alle mRNA ‘ er blev udtrykt i forhold til ekspressionen af Kristian-actin. En sammenligning af CT-værdiforhold blev brugt til at sammenligne ændringer i basal genekspression mellem AA-og PLA-grupperne. Agarosegelelektroforese under anvendelse af 25 liter alikvoter af de færdige PCR-reaktionsblandinger blev udført i 1.5% agarosegeler ved anvendelse af 1 purpur Tris-borsyre-EDTA (TBE) buffer og oplyst med en UV-transilluminator (Chemi-Doc, Bio-Rad, Hercules, CA) for at verificere positiv amplifikation af mål-mRNA (data ikke vist) . C V for MHC i, IIa og IIK var henholdsvis 2,06%, 3,18% og 2,73%.
Total muskelproteinkvantificering
Total protein tilbage fra den totale RNA-isoleringsprocedure blev isoleret med isopropanol, ethanol og 0,3 M guanidinhydrochlorid. Myofibrillar protein blev isoleret med 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS) , inden proteinindholdet bestemmes spektrofotometrisk ved anvendelse af en Bradford-analyse ved en bølgelængde på 595 nm. En standardkurve blev genereret under anvendelse af (r2 = 0,98, P < 0,001) bovint serumalbumin som standard og repræsenteret i forhold til muskelvådvægt . Hver proteinprøve blev efterfølgende fortyndet til 50 liter protein pr. 30 liter SDS-buffer til efterfølgende immunoblotting. C V for myofibrillar protein var 2,03%.
MHC-proteinisoform kvantificering
sammensætningen af MHC-proteinisoformer inden for hver muskelhomogenatprøve blev bestemt af automatiseret SDS-side ved hjælp af eksperiment Pro260 chips (Bio-Rad, Hercules, CA). Rundt regnet 6 liter alikvoter af hver prøve blev pipetteret i hver prøvebrønd på mikrochippen. Hver ukendt prøve blev fremstillet ud fra 4 liter af proteinfortyndingen fra hvert individ (eller 4 liter af molekylvægtstigen), 2 liter af prøvebuffer med liter-mercaptoethanol og 84 liter af deioniseret vand. Alle tre MHC-isoformer forventedes at migrere i 200-210 kiloDaulton-regionen inden for polyacrylamidgelen i forhold til molekylvægtstigen. Gelerne blev digitalt visualiseret af Ekspertprogrammet (Bio-Rad, Hercules, CA) og MHC-koncentrationer i hver prøve blev vurderet ved at sammenligne den vilkårlige densitet af hver MHC-isoform med de vilkårlige tætheder af molekylvægtmarkører med kendte koncentrationer. C V af proteinbåndene med 10 kD var med 1,1%.
Proteinimmunoblotting
PGF2a (FP) og PGE2 (EP3) receptor kvantificering blev udført ved stuetemperatur ved ekstraktion af total muskelprotein fra homogenatet og slot-blotting 50 liter total protein på nitrocellulosemembraner ved anvendelse af et Bio-Dot protein blotting system (Bio-Rad, Hercules, CA). De blottede membraner blev inkuberet med blokeringsopløsning i 1 time på en orbital rocker, dekanteret, og membraner blev inkuberet med en TTBS-vaskeopløsning i 5 minutter i i alt tre vaske. Membranerne blev inkuberet med specifikke anti-FP receptor og anti-EP3 receptor polyklonale antistoffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), fortyndet til 4 liter·ml-1 i 1 til 2 timer på en orbital rocker. Primære antistofopløsninger blev derefter dekanteret, og membranerne blev vasket med TTBS-opløsning i 5 minutter på en orbital rocker i alt tre vaske. TTBS-vaskeopløsningen blev dekanteret, og membranerne blev inkuberet med en sekundær biotinyleret ged-anti-kaninantistofopløsning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 time på en orbital rocker. Fortsat blev den sekundære biotinylerede ged-anti-kaninantistofopløsning dekanteret, og membranerne blev inkuberet i ttbs-vaskeopløsning i i alt tre vaske efter 5 minutter pr. Membranerne blev inkuberet med en streptavidin-biotinyleret alkalisk phosphatasekompleksopløsning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 time på en orbital rocker. Endelig blev den streptavidin-biotinylerede alkaliske phosphatasekompleksopløsning dekanteret, og membranerne blev vasket tre gange med TTBS-opløsning ved 5 minutter pr. Farveudviklingsopløsning indeholdende BCIP / NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) blev tilsat, og farveudviklingen blev overvåget i løbet af 30 – 60 minutter. Farveudviklingen blev stoppet ved at inkubere membranen i dobbeltdestilleret H2O i 10 minutter på en orbital rocker. Blottede membraner blev digitaliseret ved hjælp af densitometri ved anvendelse af et Chemi-Doc-billeddannelsessystem (Bio-Rad, Hercules, CA) og bånddensitet blev udtrykt i integrerede densitetsenheder i forhold til muskelvægt.
statistisk analyse
statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS (version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Fuldblod -, serum -, præstations-og kropssammensætningsvariabler blev analyseret ved anvendelse af 2-Karr 3 (gruppe-Karr-testsession) variansanalyse (ANOVA) med gentagne målinger univariate tests. MHC-protein -, FP-og EP3-receptorproteinniveauer blev analyseret ved anvendelse af separat 2-kar-2 (gruppe-kar-testsession) ANOVA med gentagne målinger. Derudover, i tilfælde af signifikant hovedeffekt for gruppe, envejs Anova ‘ er med gentagne målinger på testsessioner blev udført for hver gruppe for at vurdere eventuelle forskelle mellem test. Uafhængige t-tests blev brugt til at analysere ændringerne i MHC mRNA-ekspression efter 50 dages tilskud. Ud over rå score analyse, delta score analyse (dvs.dag 0 værdier trukket fra dag 25 og/eller 50) blev udført for variabler, der udviste fremmed variation mellem grupper på dag 0. Som nævnt med rå score blev en 2-Karr 3 (gruppe-Karr-testsession) variansanalyse (ANOVA) med gentagne målinger univariate tests brugt til at analysere delta-score for kropssammensætning, præstationsvariabler og hormonkoncentrationer, mens en 2-Karr 2 gentagne målinger ANOVA blev brugt til at analysere alle intramuskulære delta-score. Under omstændigheder, hvor lige afvigelser inden for grupper ikke kunne antages, blev hunyhs-Feldt epsilon-korrektionsfaktoren brugt til at justere inden for gruppe F-forhold. Under omstændigheder, hvor statistiske tendenser syntes at eksistere (dvs.P = 0,05 til 0.10) blev effektstørrelser også rapporteret som delvis eta kvadreret (np2). Partielle eta-kvadrerede effektstørrelser blev bestemt til at være svage (np2 liter 0,01), medium (np2 = 0,06), stærk = (np2 = 0,14) som tidligere beskrevet . Signifikansen for alle statistiske analyser blev bestemt ved anvendelse af et alfa-niveau på 0,05. Det skal bemærkes, at en a priori effektanalyse af designet indikerede, at en n-størrelse på 15 deltagere pr.behandling ville give en høj effekt (> 0,8) for kriterievariable delta-værdier på 0,75 til 1,25. Det skal også bemærkes, at post hoc outlier-analyse ved hjælp af boksplotter blev udført under omstændigheder, hvor der var signifikante gruppe-relations-tidsinteraktioner for at sikre, at der ikke var nogen outliers til stede. Alle data indberettes som middel til standardafvigelser (SD).