| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein strukturer: | Pfam | PDB | pdbsum | |||
Taq Pola har en övergripande struktur som liknar den för E. coli Pola. Den mellersta 3′ -5 ’ exonukleasdomänen som ansvarar för korrekturläsning har förändrats dramatiskt och är inte funktionell. Den har en funktionell 5′-3’ exonukleasdomän vid aminoterminalen, som beskrivs nedan. De återstående två domänerna agerar i samordning via kopplad domänrörelse.
Exonukleasdomainedit
Taq polymeras exonukleas är en domän som finns i amino-terminalen för Taq DNA polymeras I (termostabil). Det förutsätter ett ribonukleas h-liknande motiv. Domänen ger 5′ -3 ’ exonukleasaktivitet till polymeraset.
Till skillnad från samma domän i E. coli, som skulle försämra primers och måste avlägsnas genom matsmältning för PCR-användning, sägs denna domän inte försämra primern. Denna aktivitet används i Taqman-sonden: när dottersträngarna bildas kommer sonderna som kompletterar mallen i kontakt med polymeraset och klyvs i fluorescerande bitar.
bindning med DNAEdit
Taq-polymeras binds vid dess polymeras aktiva plats klyfta med den trubbiga änden av duplex DNA. Eftersom Taq-polymeraset är i kontakt med det bundna DNA, bildar dess sidokedjor vätebindningar med purinerna och pyrimidinerna i DNA. Samma region av Taq-polymeras som har bundet till DNA binder också med exonukleas. Dessa strukturer bundna till Taq-polymeraset har olika interaktioner.
MutantsEdit
ett platsstyrt mutagenesexperiment som förbättrar den vestigala 3′ -5 ’ exonukleasaktiviteten med en faktor 2 har rapporterats, men det rapporterades aldrig om det minskar felfrekvensen. Efter en liknande tankegång har chimera-proteiner gjorts av körsbärsplockningsdomäner från E. coli, Taq och T. neapolitana polymeras I. att byta ut den vestigala domänen för en funktionell från E. coli skapade ett protein med korrekturläsningsförmåga men en lägre optimal temperatur och låg termostabilitet.
versioner av polymeraset utan 5′ -3 ’ exonukleasdomänen har producerats, bland vilka Klentaq eller Stoffelfragmentet är mest kända. Den fullständiga bristen på exonukleasaktivitet gör dessa varianter lämpliga för primers som uppvisar sekundär struktur såväl som för kopiering av cirkulära molekyler. Andra variationer inkluderar att använda Klentaq med ett high-fidelity-polymeras, ett Termosequenas som känner igen substrat som T7 DNA-polymeras gör, mutanter med högre toleranser mot hämmare eller ”domän-taggade” versioner som har ett extra helix-hårnål-helixmotiv runt den katalytiska platsen för att hålla DNA tätare trots ogynnsamma förhållanden.
betydelse vid upptäckt av sjukdomredigera
på grund av de förbättringar Taq polymeras som tillhandahålls i PCR – DNA-replikation: högre specificitet, färre icke-specifika produkter och enklare processer och utrustning har det varit avgörande för ansträngningarna att upptäcka sjukdomar. ”Användningen av polymeraskedjereaktion (PCR) vid infektionssjukdomsdiagnos har resulterat i en förmåga att diagnostisera tidigt och behandla lämpligt sjukdomar på grund av snabba patogener, bestämma den antimikrobiella känsligheten hos långsamt växande organismer och fastställa infektionskvantum.”Implementeringen av Taq-polymeras har räddat otaliga liv. Det har tjänat en viktig roll i upptäckten av många av världens värsta sjukdomar, inklusive: tuberkulos, streptokockfaryngit, atypisk lunginflammation, AIDS, mässling, hepatit och ulcerativa urogenitala infektioner. PCR, metoden som används för att återskapa kopior av specifika DNA-prover, möjliggör sjukdomsdetektering genom att rikta in sig på en specifik DNA-sekvens av en riktad patogen från en patients prov och förstärka spårmängder av de vägledande sekvenserna genom att kopiera dem upp till miljarder gånger. Även om detta är den mest exakta metoden för sjukdomsdetektering, särskilt för HIV, utförs den inte så ofta som alternativa, sämre tester på grund av den relativt höga kostnaden, arbetet och tiden som krävs.
beroendet av Taq-polymeras som katalysator för PCR-replikationsprocessen har lyfts fram under COVID-19-pandemin 2020. Brist på det nödvändiga enzymet har försämrat ländernas förmåga att producera testsatser för viruset. Utan Taq-polymeras är sjukdomsdetekteringsprocessen mycket långsammare och tråkig.
trots fördelarna med att använda Taq-polymeras vid PCR-sjukdomsdetektering är enzymet inte utan sina brister. Retrovirala sjukdomar: HIV, HTLV-1 och HTLV-II; inkluderar ofta mutationer från guanin till adenin i deras genom. Mutationer som dessa är det som tillåter PCR-test att upptäcka sjukdomarna, men Taq-polymerasens relativt låga trohetshastighet gör att samma g-till-A-mutation uppträder och eventuellt ger ett falskt positivt testresultat.