För att utnyttja kraften i riktade målsökande endonukleaser arbetade Jerome lab för att optimera ett användbart leveranssystem för både in vivo och in vitro-studier. De använde ett adenoassocierat virus (AAV) leveranssystem för att rikta in sig på trigeminala ganglier med någon av två HSV-specifika endonukleaser: HSV1m5, som är utformad för att klyva virionproteinet VP5-genen och HS1m8, som riktar sig mot genen som kodar för DNA-polymeras katalytisk subenhet. Att skapa mutationer i någon av dessa gener orsakar störning av virusgenomet och förhindrar virionproduktion. För att ytterligare öka effekterna av behandlingen Trex-2 samtransducerades ett 3′ -5 ’ endonukleas, vilket har visat sig öka riktad mutagenes. Efter etableringen av systemet började laboratoriet in vitro-arbete med fokus på neuroner, den biologiskt relevanta celltypen. Kulturer av neuroner samtransducerades med HSV1m5 eller 8 och Trex-2 och infekterades sedan med HSV. Behandlade kulturer visade en 50% reduktion av viral titer såväl som närvaron av mutationer i HSV genom T7 Endonukleas 1-analysen och klonal sekvensering. När störning av lytisk infektion etablerades började forskarna titta på effekter på de olika stadierna av HSV-infektion. Med hjälp av infekterade kulturer av neuroner med HSV och efterföljande behandlad med HSV1m5 eller 8 med Trex-2 vid olika tidpunkter kunde forskarna simulera de olika infektionsstadierna. De behandlade kulturer vid 7 dagar (akut fas), 14 dagar (sen akut/ tidig latent fas) och 32 dagar (latent fas) och fann ingen förändring i effekt oavsett virusfas. Detta tyder på att HSV på liknande sätt är mottagligt för endonukleasmutagenes oavsett virusfas. Nivåerna av mutationer på målstället varierade från 4,5-7,6% och 1,1-6,6% för HSV1m5 respektive HSV1m8. För närvarande är detta den första studien som tittar på endonukleasaktivitet i latent infekterade neuroner.
uppmuntrat av in vitro-resultaten utförde forskarna in vivo-studier med möss infekterade med HSV följt 32 dagar senare av AAV (Uttryckande hsv1m5 eller 8 och Trex-2) injektion. Neuroner från mössen samplades 30 dagar efter AAV-injektion för viral titer, viral belastning och HSV-genommutationer. Gruppen visade 1-2% mutationer i 2/4 möss för HSV1m5 och i 3/4 möss för HSV1m8. Virusbelastningen hos dessa djur var emellertid likartad mellan kontroll-och behandlade djur. Viral utsöndring försenades med en dag hos behandlade djur men nådde liknande nivåer över tiden jämfört med obehandlade. Vid reflektion över resultaten Dr. Jerome sa, ”detta är första gången en faktisk latent virusinfektion har etablerats i ett djur, och sedan inaktiveras, även delvis, med användning av endonukleasbehandling. Så det representerar ett kritiskt steg mot att föra sådana terapier till mänsklig tillämpning. Den största utmaningen nu är att öka terapins styrka, så att hela eller nästan allt latent virus är genetiskt inaktiverat. Vi undersöker nyare, effektivare nukleaser som CRISPR / Cas och utvärderar nya metoder för att leverera nukleaserna till infekterade neuroner in vivo.”I framtiden kan denna terapi leda till ett nytt sätt att tänka på att behandla latenta sjukdomar som HSV och HIV som vi för närvarande ser som obotliga.
finansiering för denna forskning tillhandahölls av National Institutes of Health och Canadian Foundation.Aubert m,Madden EA, Loprieno m, Desilva Feelixge HS,Stensland l, Huang ML, Greninger AL, Roychoudhury P, Niyonzima N, Nguyen T, Magaret A, Galleto r, sten D, Jerome kr. 2016. In vivo störning av latent HSV genom designer endonukleasbehandling. JCI insikt, 1 (14).