experimentet
som presenteras i problemlösningstestet i det sista numret av biokemi och molekylärbiologisk utbildning regleras transkriptionsenheten som kodar för enzymerna i tryptofanbiosyntes av trp1-repressorn: tryptofan som verkar som en corepressor binder till och aktiverar repressorn, som i sin tur binder till operatörsregionen och blockerar rörelsen av RNA-polymeras och sålunda transkriptionen av strukturgenerna trp E, D, C, B och A som kodar för enzymer av tryptofansyntes. Denna hämning är emellertid” läckande”: det finns viss transkription av operonen även i närvaro av tryptofan; detta skulle slösa bort energi för att producera enzymer som inte behövs. En andra regleringsmekanism, kallad dämpning, slår ner denna kvarvarande transkription på trp operon .
en kort region mellan operatören och den första strukturella genen (trp e), kallad ledare (Fig. 1), ansvarar för dämpning. Leader-sekvensen är baspar för 140-baspar lång och koder för 5 ’ – end-regionen av trp mRNA före initieringskodon av den första strukturella genen. Leader regionen trp mRNA har en unik struktur (Fig. 2a). Den innehåller en kort öppen läsram (ORF) som kodar för en oligopeptid som kallas leader peptid. Två palindromiska sekvenser (region 1/2 och region 3/4) producerar självkomplementär basparning som leder till bildandet av hårnålstrukturer. Den andra hårnålen (region 3/4) följs av en sträcka av oss, vilket skapar en strukturell egenskap hos vissa transkriptionsterminatorer. ORF-kodningen för leader-peptiden överlappar region 1 och innehåller två kodon för tryptofan. Dessutom kompletterar regionerna 2 och 3 inte bara regionerna 1 respektive 4 utan också varandra. Denna ganska komplicerade struktur av ledarsekvensen sätter scenen för en genial regleringsmekanism för transkription av operonen.
Fig. 1. Strukturen av tryptofanoperon av E. coli.(P, promotor; o, operatör; L, ledare; E, D, C, B och A, strukturella gener. Figuren dras inte i skala: P -, O-och L-regioner är mycket kortare än proteinkodande gener.)
Fig. 2. Dämpning i regleringen av trp operon av E. coli. a) strukturen i trp‐mRNA-regionen med 5’ändar. (b) avslappning av dämpning i låg‐tryptofan medium. (c) tidig uppsägning (dämpning) av trp‐transkript i högt tryptofanmedium (för detaljer se texten).
dämpning baseras på kopplad transkription / översättning i prokaryoter: ribosomer binder till framväxande mRNA som bildar kromosom–polysomkomplex; således börjar proteinsyntesen på växande mRNA-kedjor. Om tryptofan inte är tillgängligt (Fig. 2B), stannar ribosomen i leader peptidkodande ORFs störande hårnål 1/2 och leder till bildandet av hårnål 2/3. Denna hårnål förhindrar generering av avslutningshårnålen 3/4 (kallad dämpare), och sålunda kan RNA‐polymeras fortsätta förlängningen och transkriberar hela operonen till ett fulllängdsavskrift. Men om tryptofan är närvarande fortsätter ribosomen att röra sig och förhindrar bildandet av både hårnål 1/2 och 2/3 (Fig. 2c). Dämparen hårnål 3/4 kan bilda och avslutar transkription. Leader-peptiden och det korta leader-RNA försämras sedan snabbt och de strukturella generna transkriberas inte. Granska mekanismen och lösa följande test.
i detta fiktiva experiment används två trp-operonmutanter: i en av dem omvandlades de två ugg-kodonerna som kodade för tryptofan till GGGs (kodon för glycin; betecknad ”trp-kodonmutant” under hela testet); i den andra raderades region 3 (”region 3 mutant”).
Wild‐Typ E. coli-celler,” trp-kodonmutanter ”och” region 3-mutanter ” odlas i ett rikt medium innehållande alla aminosyror (inklusive tryptofan) i optimala koncentrationer. Vad händer med dem?
Experimentanalys
- (a)
om uttalandet stöds av den information som ges;
- (b)
om uttalandet motsägs av den information som ges;
- (c)
om uttalandet varken stöds eller motsägs av den information som ges.
- 1)
_____ ”Trp codon mutant” celler dör.
- 2)
_____ vilda celler växer snabbast.
- 3)
_____ ”Region 3 mutant” celler växer långsammaste under sådana förhållanden.
- 4)
_____ kromosom–polysomkomplex bildas på trp-operonen i alla tre cellerna.
- 5)
_____ tryptofan syntetiseras i betydande mängder endast i ”region 3 mutanta” celler.
- 6)
_____ _ med hjälp av ett trp leader DNA‐fragment som en sond identifierar Northern blot-analys av cellulärt RNA i ”trp-kodonmutanter” ett starkt band som motsvarar ett 140-nukleotid-RNA.
- 7)
__ _ _ _ med samma sond detekteras stora mängder trp‐operon i full längd i RNA-prover av vildtyp.
samma celler odlas nu i ett medium innehållande alla aminosyror utom tryptofan. Hur beter sig cellerna under sådana förhållanden?
Experimentanalys
- (a)
om uttalandet stöds av den information som ges;
- (b)
om uttalandet motsägs av den information som ges;
- (c)
om uttalandet varken stöds eller motsägs av den information som ges.
- 8)
_____ ”Trp codon mutant” celler dör.
- 9)
_____ vilda celler växer snabbast.
- 10)
__ _ _ _ ”Region 3 mutanta” celler växer långsammaste under sådana förhållanden.
- 11)
_____ kromosom-polysomkomplex bildas på trp-operonen i alla tre cellerna.
- 12)
_____ tryptofan syntetiseras i betydande mängder endast i” region 3 mutanta ” celler.
- 13)
_____ _ med hjälp av ett trp leader DNA‐fragment som en sond identifierar Northern blot-analys av cellulärt RNA i ”trp-kodonmutanter” ett starkt band som motsvarar ett 140-nukleotid-RNA.
- 14)
_____ med samma sond detekteras stora mängder trp‐operon i full längd i RNA-prover av vildtyp.