presynaptisk hyperpolarisering inducerar en snabb analog modulering av spike-framkallad överföring medierad av axonala natriumkanaler

Hyperpolariseringsinducerad ad-underlättande

vi mätte först förekomsten av kort hyperpolarisering av den presynaptiska cellen på synaptisk överföring. Par av monosynaptiskt anslutna CA3-neuroner registrerades i organotypiska kulturer av råtthippocampus efter 8-10 dagar in vitro (DIV)21. En 200 ms hyperpolariserande prepuls levererad före den presynaptiska spiken befanns öka synaptisk styrka med 20% (Fig. 1a). Denna ökning observerades vid mätning av antingen amplitud eller laddning av det postsynaptiska svaret (kompletterande Fig. 1). I dessa experiment var den presynaptiska vilopotentialen -74 3 MV (n=10). H-ADF var jämförbar när den presynaptiska hyperpolariseringen uppgick till -84 eller -102 MV (respektive 124 8% 819 5%, n=10; Wilcoxon test P>0.1), vilket tyder på att en presynaptisk hyperpolarisering av 10 mV MV är tillräcklig för att erhålla mättande h-ADF. h-ADF var associerat med ett reducerat parat Pulsförhållande (PPR, från 99 7 till 88 5%, n=12; Wilcoxon test p<0,05; kompletterande Fig. 1), vilket indikerar att det är resultatet av en presynaptisk ökning av glutamatfrisättning.

en 200-ms-lång hyperpolarisering är osannolikt att inträffa i ett fysiologiskt sammanhang. Därför undersökte vi tidsförloppet för h-ADF för kortare hyperpolariseringar (15, 50, 100 och 200 ms). h-ADF observerades för alla varaktigheter av hyperpolarisering testad (15 ms: 111 3%, 50 ms: 116 4%, 100 ms: 109 4%, 200 ms: 120 6% 6 Wilcoxon, p<0,05 för alla varaktigheter, n=7, Fig. 1b). Enligt detta resultat kommer h-ADF sannolikt att induceras genom fysiologisk hyperpolarisering.

CA3 pyramidala neuroner uttrycker DEPOLARISERINGSINDUCERAD ad-underlättande (d-ADF) som är resultatet av långsam inaktivering av Kv1.1-kanaler (tidskonstant: 3.3 s)13. Vi undersökte således om både d – och h-ADF uttrycktes vid samma CA3–CA3-anslutningar. Presynaptiska APs utlöstes alternativt från Vilande membranpotential (-78 MV-Kontroll), efter en lång subtröskeldepolarisering (10 s, -62,6 mV, d-ADF), efter en kort hyperpolarisering (200 ms, -96,1 mV, h-ADF) eller efter kombinationen av en lång depolarisering och en kort hyperpolarisering (d – och h-ADF; Fig. 1C, vänster). I själva verket producerade kombinationen av de två formerna av ADF, i samma anslutningar, en större underlättande (113 kg 3%, n=16; Fig. 1c) än den som produceras separat av varje protokoll (enbart D-ADF: 105 3%, n=16, endast H-ADF: 108 4%, n=11; Fig. 1c). I synnerhet befanns medelvärdet h – och d-ADF summera linjärt, vilket tyder på två oberoende molekylära mekanismer. Dessutom var d-och h-ADF mätt i samma par positivt korrelerade (kompletterande Fig. 1), vilket tyder på att vissa synaptiska anslutningar är mer mottagliga för AD-underlättande, förmodligen för att Analog signalutbredning längs axonen beror på avståndet mellan soma och de presynaptiska terminalerna. Dessa data visar att h – och d-ADF samexisterar i CA3-pyramidala neuroner och att de underliggande mekanismerna sannolikt kommer att vara oberoende.

h-ADF observerades hos unga CA3-neuroner (DIV8–10 framställda från P5–P7-råttor), och sålunda kan det huvudsakligen bero på lågdensitets-eller omogna egenskaper hos spänningsgrindade jonkanaler. Vi bestämde därför om h-ADF också hittades i mogna CA3-pyramidala celler. Parade inspelningar av anslutna CA3-neuroner erhölls i div24-DIV32-skivkulturer. Kort presynaptisk hyperpolarisering (200 ms) ökade signifikant synaptisk Styrka (104.2 kg 1,1% n = 25; Wilcoxon, p<0,01; kompletterande Fig. 2). h-ADF mätt i mogna celler var mindre än det som mättes i utvecklande neuroner (Mann–Whitney, P<0,01; kompletterande Fig. 2). Vi drar därför slutsatsen att h-ADF är utvecklingsreglerat i CA3-neuroner in vitro.

alla inspelningar erhölls med högt extracellulärt kalcium (3 mM) för att optimera synaptisk styrka. Under dessa förhållanden är sannolikheten för presynaptisk frisättning hög och presynaptisk underlättande såsom h-ADF kan underskattas. Vi mätte därför h-ADF i mogna CA3-neuroner (DIV24–DIV32) registrerade med fysiologiskt extracellulärt kalcium (1,3 mM)22. Under dessa förhållanden befanns h-ADF vara cirka +16,4% (Wilcoxon, P<0,01; kompletterande Fig. 2). Vi drar slutsatsen att h-ADF uttrycks robust i mogna neuroner registrerade i fysiologiskt extracellulärt kalcium.

h-ADF induceras av simulerade IPSPs och svängningar

för att undersöka h-ADFS roll under nära fysiologiska förhållanden infördes en GABAA-liknande konduktans i den presynaptiska neuronen med hjälp av dynamisk klämma (Fig. 2A, vänster). I överensstämmelse med resultat som illustreras i Fig. 1, ApS som föregicks av injektionen av en IPSC-liknande ström gav ett större svar i den postsynaptiska neuronen jämfört med APs utlöst från Vilande membranpotential (Wilcoxon P<0,001, n=11). I överensstämmelse med en presynaptisk höjning av glutamatfrisättning reducerades PPR när simulerade Gabaergiska IPSP föregick APs (från 121% i kontroll till 96%; Wilcoxon P<0,05, n=7; data visas inte). Intressant visade sig storleken på den synaptiska potentieringen vara beroende av storleken på den simulerade IPSP (R2=0,39, P<0,05), vilket indikerar att h-ADF graderas mellan Vilande membranpotential (-74 mV) och 10-mV hyperpolarisering (-84 MV; Fig. 2A, höger). Faktum är att underlättningsfaktorn i detta intervall befanns vara 1,8% per MV av hyperpolarisering.

vi undersökte därefter moduleringen av synaptisk styrka under presynaptisk membranpotentialoscillation. Oscillation av den presynaptiska membranpotentialen vid 4 Hz framställdes genom injektion av sinusformad ström och enstaka presynaptiska spikar framkallades vid olika faser av oscillationen. I överensstämmelse med de tidigare resultaten observerades h-ADF när cellen avfyrades under hyperpolariserande faser av oscillationen (0 ms: 124,3 7%, 250 7%, 122 7%, Wilcoxon P<0,05, n=8; Fig. 2b). Vid andra faser är den synaptiska styrkan oförändrad (56 ms: 112,2 6%, 163 ms: 95,8 5%, 211 ms: 110,5 6%, Wilcoxon p>0,1, n=8). I synnerhet observeras ingen d-ADF med depolariseringen eftersom dess varaktighet är för kort för att inaktivera Kv1.1-kanaler13. Vi drar slutsatsen att oscillationer i intervallet för att framkalla h-ADF i CA3-neuroner.

h-ADF är associerad med en ökning av axonal spikamplitud

därefter undersökte vi mekanismerna bakom h-ADF. En möjlig mekanism för h-ADF är en modulering av den presynaptiska spikamplituden inducerad av hyperpolariseringen. Vi undersökte därför konsekvensen av hyperpolarisering på spikamplituden mätt i axonen. CA3-neuroner fylldes med Alexa 488 (50 cdr) för att visualisera axonarboriseringen, och cellfästa inspelningar erhölls från axonen på avstånd mellan 60 och 240 cdr (Fig. 3a). Vid somatisk hyperpolarisering förstärktes amplituden hos den axonala spiken (106 ml 1% av kontrollamplituden, n=6, Wilcoxon, P < 0,05; Fig. 3b). Emellertid befanns storleken på axonal spiklättring minska med axonalavståndet med en rymdkonstant på 212 Crimson (Fig. 3b). Sammanfattningsvis är h-ADF i CA3-neuroner associerad med en lokal ökning av spikamplitud i axonen.

medan helcellsinspelning från CA3 axoner är extremt svår i organotypiska kulturer, kan den erhållas i L5 pyramidala neuroner från akuta skivor5,6. Därför mätte vi först om h-ADF också kunde observeras vid L5–L5 excitatoriska anslutningar. Par monosynaptiskt anslutna L5-pyramidala neuroner registrerades i akuta skivor från sensori-motoriska cortex hos unga råttor (P14–P20). Kort hyperpolarisering i soma (200 ms, 10-15 mV) av den presynaptiska neuronen befanns förbättra synaptisk styrka (109,6 2,3%, n=13, Wilcoxon-test, P<0,05; Fig. 4a).

för att bekräfta att h-ADF i L5 pyramidala neuroner var associerad med axonal spikamplitudökning, erhölls samtidiga helcellsinspelningar från SoMa och cut-end axoner (blebs) (50-80 CGR från soma) i L5 pyramidala neuroner. Övergående hyperpolarisering av soma (ungefär -13 mV) förstärkte amplituden för spiköverskottet i axonen men inte i Soma (+5,5 1,5 kg mot -0,3 1,1 MV 1,1 kg, N=5, Mann–Whitney, P<0,05; Fig. 4b). Hastigheten för depolarisering förstärktes också (från 251 59 till 289 56 56 MV ms−1, n=5) och spikgränsen hyperpolariserades (från -35,7 5,2 till -38,8 4,3 MV, n=5). Vi drar slutsatsen att h-ADF i både CA3 och L5 pyramidala celler är associerad med ökningen av spikamplituden mätt i axonen.

h-ADF är associerad med förbättrade axonala kalciumsignaler

Vi använde nästa Ca2 + avbildning för att bestämma konsekvensen av hyperpolarisationsinducerad förbättring av spikamplitud i axonen. CA3-pyramidala neuroner fylldes med 50 crunch Alexa-594; 250 crunch Fluo – 4 och spike-framkallade kalciumsignaler mättes i förmodade en passant boutons på avstånd mellan 150 och 250 crunch från soma (Fig. 5a). Integralen av den spike-framkallade Ca2 + övergående ökades när den presynaptiska spiken framkallades efter en övergående hyperpolarisering av 20 MV (126 10%, n=5; Fig. 5b). Vi drar slutsatsen att presynaptisk hyperpolarisering under h-ADF ökar både presynaptisk spikamplitud och spikinducerad Ca2+-tillströmning, vilket därefter förbättrar glutamatfrisättning.

nav-kanalinaktivering i axonen bestämmer h-ADF

den ökade amplituden för axonal spik under hyperpolarisering kan bero på återhämtning av Nav-kanaler från inaktivering. För att bekräfta rollen som natriumkanalinaktivering i h-ADF använde vi en NEURONMODELL av två monosynaptiskt anslutna CA3-neuroner. Vi bestämde sedan förekomsten av modifierande inaktivering av natriumkanaler i axonen på h-ADF. När halvinaktiveringen av axonala natriumkanaler sattes till -80 mV (refs 18, 19) förstärkte somatisk hyperpolarisering spikens Amplitud, laddningen av spike-framkallad kalciumström och synaptisk överföring (Fig. 6A, vänster). Detta beror på återhämtningen av Nav-kanaler från inaktivering genom hyperpolarisering (Fig. 6B, vänster). Ingen förändring inträffade emellertid om halvinaktiveringen av de axonala natriumkanalerna var inställd på -70 mV (Fig. 6A, höger). I det senare fallet är andelen tillgängliga Nav-kanaler redan mycket hög vid vilande membranpotential, vilket ger en AP med full amplitud (Fig. 6a, b, höger). Därför påverkar återhämtningen från inaktivering inte ytterligare den presynaptiska spikamplituden. Således beror h-ADF i modellen på återhämtningen av Nav-kanaler från inaktivering och ökas genom hyperpolarisering av Nav-halvinaktivering (Fig. 6c).

dessutom använde vi vår NEURONMODELL för att simulera axonal Nav-kanaltillgänglighet under en theta-svängning som liknar den som används i Fig. 2b. Nav-kanaler befanns inaktivera under depolarisering och återhämta sig under hyperpolarisering, förklarar EPSC-moduleringen under oscillationen (kompletterande Fig. 4). Inaktivering är dock snabbare än återhämtning under svängningen på grund av den långsammare Navkinetiken vid depolariserade potentialer (kompletterande Fig. 4). Detta förklarar varför Epsc: erna som producerades vid 163 ms inte presenterade någon h-ADF, även om spiken emitteras från en något hyperpolariserad potential (Fig. 2b). Faktum är att Nav-kanalerna vid denna punkt av oscillationen inte hade tillräckligt med tid att återhämta sig från inaktivering (kompletterande Fig. 4).

sammantaget stöder dessa resultat det faktum att h-ADF beror på återhämtning av Nav-kanaler från inaktivering.

Nav kanaltäthet bestämmer styrkan hos h-ADF

h-ADF beror på tillgängligheten av natriumkanaler i axonen. Således bör minskning av densiteten hos Nav-kanaler påverka h-ADF. I själva verket visade vår modell att minska Nav kanaltäthet till 70% av kontroll skick förbättrad h-ADF från 130 till 180% (Fig. 7a). Den kritiska parametern här var förstärkningen av presynaptisk spiköverskott som beror på aktiverbar na-konduktans (Fig. 7b). Under kontrollförhållande var detta värde redan högt och hyperpolarisering av det presynaptiska elementet från -78 till -93 mV förbättrade spikens amplitud med 28%. När densiteten hos Nav reducerades förstärkte samma hyperpolarisering amplituden hos den presynaptiska AP med 42%.

vi verifierade därefter experimentellt att minskning av Nav-kanaltätheten ökade h-ADF i CA3-neuroner. Vi blockerade därför delvis Nav-kanaler med en låg koncentration av tetrodotoxin (TTX) applicerad i badet (15-25 nM). Vid denna koncentration blockerar TTX 80% av Na+ – strömmen men bevarar induktion av snabba Na+ spikes24,25. I närvaro av TTX reducerades spikamplituden i soma med 45 ml 4% (n=9) och synaptisk överföring vid CA3–CA3-anslutningar reducerades med 55 ml 8% (N=9; kompletterande Fig. 5). Viktigast av allt, att minska andelen aktiverbara Nav-kanaler med 15-25 nM TTX befanns kraftigt förbättra h-ADF i mogna neuroner som inte uttryckte någon h-ADF (från 103 ml 3% i kontroll till 121 ml 4% i närvaro av TTX, n=6, Wilcoxon P<0,05; Fig. 7c, d). Dessa data bekräftar därför att h-ADF i CA3-neuroner beror på tillgängligheten av Nav-kanaler.

t-Typ Ca2+ kanaler finns i axonen. De kan aktiveras under hyperpolarisering-depolariseringssekvensen som används för att inducera h-ADF och kan således redogöra för h-ADF. Emellertid befanns h-ADF förbli stabil i närvaro av 100 nM mibefradil, en T-typ kanalblockerare (från 112,2 1,1% i kontroll till 116,2 11,9% med mibefradil, n=3; data visas inte), vilket tyder på att t-Typ Ca2+-kanaler inte deltar i h-ADF.

h-ADF främjar nätverkssynkronisering

Vi testade därefter implikationen av h-ADF i nätverkssynkronisering med hjälp av en hippocampal nätverksmodell bildad av 80 pyramidala liknande excitatoriska celler (e-celler) och 20 interneuronliknande hämmande celler (i-celler) sammankopplade (Fig. 8a; se metoder). e-och i-celler matades av stokastisk inmatning. Nätverket av e-celler synkroniserades och oscillationer i gammaområdet verkade som synaptisk styrka mellan e-celler ökade (kompletterande Fig. 6). Dessa svängningar drevs av i-celler: aktivering av e-celler befanns främja aktiveringen av i-celler, vilket i sin tur tystade hela nätverket (kompletterande Fig. 6). Eftersom h-ADF ökar interpyramidal synaptisk styrka när den presynaptiska spiken föregås av en IPSP, är h-ADF en bra kandidat för att främja dessa i-celldrivna svängningar.

h-ADF-regeln införlivades i nätverket genom att öka synaptisk styrka mellan e-celler enligt membranpotentialen uppmätt 17 ms före spiken. Faktum är att synaptisk styrka ökade med 20% om den presynaptiska potentialen var under -84 mV (Fig. 8b). Denna regel härleddes direkt från värden uppmätta experimentellt (Se Fig 1a och 2a). För en e-cell-synaptisk styrka på 2,8 mS, adderade h-ADF i nätverket markant både avfyrningsfrekvensen och synkroniseringen över e-celler (Fig. 8c-e). Faktum är att benägenheten att oscillera i gammaområdet underlättades kraftigt om h-ADF mellan e-celler var effektiv (Fig. 8e). Intressant nog, i ett nätverk med skakningsinhibering (ECl=-73 mV istället för -80 mV i kontrollförhållande) förbättrade h-ADF-regeln inte synkroniseringen och främjade inte gammaoscillationer (kompletterande Fig. 6). Men eftersom h-ADF ökar den synaptiska styrkan mellan e-celler, kan dess synkroniseringseffekt helt enkelt bero på ökningen av nätets spikhastighet. För att öka spikhastigheten utan att påverka synaptisk styrka bestämde vi oss för att fixa inter-e-cellstyrkan vid 2,5 mS och öka den externa drivfrekvensen för e-celler från 6 till 20 Hz. Vi ritade synkroniseringskoefficienten mot nätets spikhastighet. Även om synkronisering visade sig vara linjärt korrelerad med spikhastighet ökade h-ADF synkroniseringskoefficienten för en given spikhastighet i 4-14 Hz-intervallet (kompletterande Fig. 6). Detta visade att för låg spikhastighet ökar h-ADF synkroniseringen oberoende av den genomsnittliga nätverksaktiviteten. Sammanfattningsvis ökar h-ADF i vår modell nätverkssynkronisering och främjar svängningar genom att länka interpyramidal synaptisk styrka med interneurons aktivitet.