1 teori
oligonukleotider syntetiseras genom tillsats av en bas i taget, som sträcker sig från 3′ till 5′-änden, fäst vid ett fastfasstöd. När den kemiska syntesen av oligonukleotiden är fullständig frigörs DNA-kedjan från det fasta stödet genom inkubation med ammoniumhydroxid. Ammonium fungerar också som ett deprotektivt medel, klyver av grupperna som skyddar fosfaterna i fosfodiesterbindningarna. Därefter tillsätts varm ammoniak för att hydrolysera skyddsgrupperna från de exocykliska aminogrupperna av deoxiadenosin, deoxicytosin och deoxyguanosin. Oligonukleotiden kan levereras till användaren i ammoniaklösningen som en råberedning. I detta fall kan det före användning vara nödvändigt att utföra ett ytterligare steg för att avlägsna salter och biprodukter från oligonukleotidpreparatet som genereras under avskydd.
efter deprotektion avsaltas oligonukleotidpreparatet vanligtvis, kvantifieras, indunstas till torrhet i en lyofilisator och levereras till användaren i form av ett pulver. Den avsaltade oligonukleotidlösningen innehåller oligonukleotiden i full längd men innehåller också en blandning av stympade produkter som ackumulerades under den kemiska syntesen. Trunkering inträffar när den angivna basen inte lägger till kedjan i motsvarande cykel (Hecker & Rill, 1998). Således bestäms procentandelen av stympade produkter som ackumuleras i beredningen av synteseffektiviteten (fraktionen av fulllängdsprodukt efter syntes) och molekylens längd. Långa oligonukleotider, som kräver att fler cykler syntetiseras, är mindre rena än korta oligonukleotider. Dessa fel kan konkurrera med fullängdsprodukten i vissa applikationer och kan behöva avlägsnas innan oligonukleotiden kan användas. Avsaltade oligonukleotidpreparat är emellertid vanligtvis lämpliga för många applikationer, såsom standard PCR eller mikroarrayer, speciellt om oligonukleotiden är < 20 nukleotider i längd.
ytterligare rening för oligonukleotider längre än 50 baser rekommenderas eftersom andelen fulllängdsprodukt i beredningen vanligtvis inte är högre än 80%. För krävande applikationer där oligonukleotidens exakta längd är viktig, såsom gelskiftanalyser, platsstyrd mutagenes, sekvensering, produktion av kloningsadaptrar eller cDNA-syntes i första strängen för generering av bibliotek, rekommenderas ytterligare rening, även för kortare oligonukleotider (se mer information om teknikerna ovan på Standard in vitro-analyser för protein-Nukleinsyrainteraktioner-Gelskiftanalyser för RNA – och DNA-bindning och Platsstyrd mutagenes).
rening kan krävas efter syntes eller efter enzymatisk modifiering av oligonukleotiden. Det finns flera metoder för att uppnå detta, och valet beror på oligonukleotidens natur och applikationen som den är avsedd för.
omvänd fas HPLC-rening är baserad på hydrofobicitet. Den använder en icke-polär stationär fas och vattenhaltiga buffertar och organiska lösningsmedel som mobil fas för att eluera analyterna; polära föreningar elueras först, medan icke-polära föreningar behålls. Detta är den bästa metoden för rening av oligonukleotider modifierade med en hydrofob grupp, såsom biotin, fluorescerande färgämnetiketter eller NHS-esterkonjugationer. Massåtervinningen är högre än vid användning av SIDRENING och det är mottagligt för rening av större mängder oligonukleotider (mmol skala), även om det inte tar bort ofullständiga produkter så effektivt. Oligonukleotidreningspatroner, baserade på omvänd fas kromatografi, ger en snabb metod för avsaltning och rening av oligonukleotider.
Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) löser oligonukleotider enligt deras längd och erbjuder därmed tillräcklig upplösning för att skilja produkter i full längd från misslyckade molekyler (Atkinson och Smith, 1984). Polyakrylamidgeler är mer effektiva för att separera små fragment av DNA än agarosgeler (se analys av RNA genom analytisk polyakrylamidgelelektrofores och agarosgelelektrofores). Den enda nackdelen med polyakrylamidgeler är att de är svårare att förbereda och hantera än agarosgeler. Polyakrylamidgeler körs i en vertikal konfiguration i ett konstant elektriskt fält. Efter elektrofores elueras oligonukleotiden från gelen och koncentreras med användning av etanolutfällning (hitta mer om utfällning av nukleinsyror på RNA – reningsutfällningsmetoder) eller omvänd fas kromatografi. Detta är den metod som valts när den högsta andelen oligonukleotider i full längd önskas för krävande applikationer. Det rekommenderas också starkt för oligonukleotider längre än 30 baser. Dessutom kan flera prover köras samtidigt och ingen dyr utrustning krävs. Den enda nackdelen med denna teknik är den lilla mängd oligonukleotid erhållen per rening. Typiskt används oligonukleotider i skalan av 1 eller mindre, och massåterställningen efter sidrening är < 50% och ännu lägre vid modifierade oligonukleotider. Trots att utbytet är lågt är det tillfredsställande för de flesta biokemiska tillämpningar.
oligonukleotidpreparatet laddas på en denaturerande polyakrylamidgel i en mängd av minst 1 mg per körfält. Gelens upplösningsområde beror på koncentrationen av polyakrylamid. För korta oligonukleotider (från 15 till 35 baser) rekommenderas 13-15% polyakrylamidgeler; för längre oligonukleotider (från 35 till 70 baser) rekommenderas 8-13% polyakrylamidgeler. Procentandelen av gelen bör anpassas till körsystemet. Vi använder vanligtvis Bio-Rad Mini Protean II-systemet och kör 15% geler för att rena oligonukleotider med 25 baser i längd. Efter identifiering av rätt band genom UV-visualisering skärs bandet ut och extraheras från gelen.
två olika metoder för att rena oligonukleotider från polyakrylamidgeler beskrivs i detta kapitel. Den enklaste metoden är eluering genom diffusion. Detta är baserat på rörelsen av molekyler från en region med högre koncentration till en av en lägre koncentration. Resultatet av diffusion är en gradvis blandning av material. Denna metod är tidskrävande men det kräver inte för mycket arbete eller någon utrustning. I grund och botten skivas polyakrylamidbandet innehållande oligonukleotiden av intresse i små bitar och täcks med elueringsbuffert. Efter inkubation renas DNA från supernatanten genom etanolutfällning. Utbytet är begränsat, mellan 20% och 70%, beroende på längden på oligonukleotiden. Ju större mängd elueringsbuffert som används, desto mer oligonukleotid diffunderas från gelen.
den andra metoden är elektroelution i en dialyspåse (McDonell et al., 1977). Gelstycket innehållande oligonukleotiden skärs ut och placeras i en dialyspåse med en buffert. Appliceringen av en elektrisk ström får DNA att migrera ut ur gelen i dialyspåsens buffert. Oligonukleotiden återvinns från denna buffert och renas. Med hjälp av denna metod kan oligonukleotiden isoleras med ett bra utbyte, även om det är tidskrävande om ett stort antal prover renas samtidigt, eftersom det kräver införande av varje Gelband i enskilda dialyspåsar. Denna metod fungerar också bra för större DNA-fragment och kan till och med användas för att extrahera DNA från agarosgeler.