gränser i neurovetenskap

introduktion

på nittonde århundradet, 80 år efter upptäckten av laktat (La−) av Scheele (Kompanje et al., 2007), Louis Pasteur märkte att fakultativa jästceller växte mer under aeroba än anaeroba förhållanden, men konsumtionen av socker minskade och jäsning till alkohol var mindre under aeroba förhållanden (Pasteur, 1861). Tidigare hade Pasteur (1858) erkänt att vissa typer av jästfermenterat socker till La− under anaeroba men inte aeroba förhållanden. Detta fenomen (för både alkohol och La-jäsning) har kallats Pasteur-effekten (Barnett och Entian, 2005). Ett parallellt fenomen upptäcktes i skelettmuskler och hela djur. För skelettmuskel Fletcher och Hopkins (1907) rapporterade att La− upplupna i anaeroba grodmuskler i vila. Under stimulering ökade la-koncentrationen () snabbt i anaerob amfibiemuskel, men försvann när dessa trötta muskler fick återhämta sig i en syre (O2) rik miljö. Därefter visade Meyerhof slutgiltigt att glykogen var föregångaren till La-In isolerade muskler, och den fullständiga glykolytiska vägen belystes i början av 1940-talet (Meyerhof, 1942; Brooks och Gladden, 2003). Den traditionella dogmen byggdes på denna ram och annan forskning om hypoxi: Pyruvat är slutprodukten av glykolys under aeroba förhållanden och La− är slutprodukten när O2 är otillräcklig. Schurr (2006) diskuterade denna dogma ur hjärnmetabolismens synvinkel.

det är allmänt accepterat att intracellulära PO2-värden på 0,5 Torr eller mindre resulterar i O2-begränsad oxidativ fosforylering, ett tillstånd som kallas dysoxi (Connett et al., 1990), med efterföljande La− produktion och ackumulering. Stainsby och Welch (1966) rapporterade emellertid La− efflux från en uppenbarligen välsyrad kontraherande muskel. Därefter observerade J Ubibsis och Stainsby (1968) La− produktion och frisättning från en kontraherande skelettmuskel medan NAD+/NADH redox-paret blev mer oxiderat, en indikation på tillräcklig O2-tillförsel. Med hjälp av ett annat tillvägagångssätt, myoglobin cryomicrospectroscopy, för att bestämma PO2 hos hund gracilis muskel kontraherar vid progressivt snabbare hastigheter, Connett et al. (1986) fann ökande La− efflux utan bevis på dysoxi; De lägsta PO2-värdena var i allmänhet i storleksordningen 2 Torr. Richardson et al. (1998) använde protonmagnetisk resonansspektroskopi (MRS) för att bestämma myoglobinmättnad (och därmed intracellulär PO2) hos människor under graderad träning. I parallella experiment med samma typ av träning bestämdes La− efflux via arteriovenösa koncentrationsskillnader och blodflöde. De fann La-efflux i närvaro av intracellulära PO2-nivåer (~3 Torr) som inte bör begränsa oxidativ fosforylering. V bajsa et al. (1998) rapporterade också att isolerad, stimulerad nervvävnad frigör laktat under aeroba förhållanden.

dessa fynd, tillsammans med andra rikliga indicier tyder på att netto la− produktion och utflöde från celler kan förekomma under aeroba förhållanden (Gladden,2004A, b). I själva verket föreslog Brooks (2000) att ” laktat producerades hela tiden i helt syresatta celler och vävnader.”Schurr (2006) diskuterade detta förslag i detalj och föreslog att” glykolys alltid fortsätter till sitt sista steg, LDH-reaktionen och bildandet av laktat ” i hjärnvävnad men troligen också i många andra vävnader. Därefter gav Schurr och Payne (2007) och Schurr och Gozal (2012) stödjande experimentella bevis för detta postulat i hippocampala hjärnskivor. Här omfamnar vi detta koncept och föreslår att även i frånvaro av netto la− ackumulering, och i närvaro av riklig O2, La− är den naturliga slutprodukten av glykolys. Viktigt, vi använder grundläggande biokemiska principer för att undergird detta koncept och återinföra Cytosol-till-mitokondrier Laktatbuss.

LDH− reaktionen är en nära Jämviktsreaktion

La−bildas i följande reaktion som katalyseras av enzymet laktatdehydrogenas (LDH):

jämviktskonstanten är starkt till förmån för La−(1,62 mikron 1011 M-1) (Lambeth och kushmerick, 2002) och LDH-aktivitet är hög i förhållande till de förmodade reglerande enzymerna i den glykolytiska vägen i skelettmuskel (Connett och Sahlin, 2011), lever, njure, hjärtmuskel, mjälte och fett (shonk och Boxer, 1964), hjärna (iwangoff et al., 1980; Morland et al., 2007), och både maligna och godartade brösttumörer (Larner och Rutherford, 1978; Balinsky et al., 1984). Viktigt är att LDH-aktivitet också är hög i jämförelse med de förmodade reglerande enzymerna för pyruvatoxidation; se Spriet et al. (2000) för skelettmuskler, Morland et al. (2007) för hjärnan, och Marie och Shinjo (2011) för hjärncancer. Medan mått på vävnads-La-till pyruvatförhållanden är knappa, är vissa exempelvärden 7:1 för lever (Liaw et al., 1985), 10-13:1 för vilande skelettmuskel (Sahlin et al., 1976; Liaw et al., 1985), och värden så höga som 159:1 i skelettmuskel omedelbart efter uttömmande dynamisk träning (Sahlin et al., 1976). Referensvärden för La-till pyruvatförhållandet i hjärnan, med hjälp av mikrodialysprober, genomsnitt 23:1 (Reinstrup et al., 2000; Sahuquillo et al., 2014). Typiskt stiger förhållandet efter traumatisk hjärnskada, även i frånvaro av ischemi eller LÅGVÄVNADSPO2 {XII 25(Sahuquillo et al., 2014); 40 (Vespa et al., 2005)}. Trots standardisering av tekniker återspeglar mikrodialysvärden inte nödvändigtvis verkliga vävnadskoncentrationer (Sahuquillo et al., 2014). Ändå är dessa La-till pyruvatmikrodialysvärden för mänsklig hjärna inte långt borta från värden (bisexuella 13:1) erhållna på råtthjärnhomogenater (Ponten et al., 1973). Sammantaget förstärker den höga relativt till och med med tillräcklig O2− försörjning LDH-aktivitetens roll vid bestämning av La-utseende. Den höga LDH-aktiviteten och La− lutande jämviktskonstanten för LDH-reaktionen är viktiga element i förslaget att La-är den viktigaste slutprodukten av glykolys under väsentligen alla metaboliska förhållanden. Enkelt uttryckt, när som helst glykolys är operativ, oavsett lokal syrespänning, La− bildas i de flesta typer av vävnader. Mängden la-producerad och faktiskt ackumulerad (dvs en ökad ) kan emellertid förändras av faktorer som O2-spänning, metabolisk hastighet, tillgänglig mitokondriell aktivitet och andra faktorer.

öden av pyruvat

potentiella öden av pyruvat listas nedan. Vi föreslår att ingen av dessa processer sker i en takt som matchar den initiala omvandlingen av pyruvat till La−, vilket säkerställer att La− alltid är slutprodukten av glykolys.

1. Utflöde från cellen främst via monokarboxylattransportörer (MCT). La-är emellertid alltid närvarande i en högre koncentration än pyruvat och kommer att avvika celler i en snabbare takt än pyruvat.

2. Omvandling till alanin via nära jämvikt alaninaminotransferas reaktion som har en jämviktskonstant på cirka 1 (Tiidus et al., 2012), så alaninkoncentrationen bör approximera pyruvatkoncentrationen och omvandlingen av pyruvat till alanin bör inte förringa omvandlingen av pyruvat till La−.

3. Glukoneogena / Glykoneogena reaktioner. I glukoneogena vävnader kan pyruvat omvandlas till oxaloacetat i en reaktion katalyserad av pyruvatkarboxylas (Pascoe och Gladden, 1996). I skelettmuskelglykoneogenes kan pyruvat omvandlas till malat med katalys av äppelenzym (Pascoe och Gladden, 1996) eller mer sannolikt att fosfoenolpyruvat via återföring av pyruvatkinasreaktionen (Donovan och Pagliassotti, 2000). Dessa reaktioner representerar” återföring ” av glykolys och de börjar med La−, den naturliga slutprodukten av glykolys. I hjärnan är glykogen vanligast i astrocyter och gles till försumbar i neuroner (Cataldo och Broadwell, 1986). Även om pyruvatkarboxylas uttrycks i odlade astroglialceller, oligodendrocyter, mikroglialceller och ependymocyter (Murin et al., 2009), vi är omedvetna om någon information om förmågan hos någon av dessa celler att syntetisera glykogen från La−.

4. Transport över det mitokondriella inre membranet med efterföljande omvandling till Acetyl-CoA via pyruvatdehydrogenas (PDH) – reaktionen följt av inträde i trikarboxylsyracykeln och oxidation. Pyruvat korsar det inre mitokondriella membranet via enkel diffusion och underlättad diffusion; transportörerna är en MCT (Hashimoto et al., 2006) och mitokondriell pyruvatbärare (Divakaruni och Murphy, 2012). För pågående oxidation av pyruvat är NADH-skytteln i mitokondriell matris av malat-aspartat och glycerolfosfatskyttlarna lika viktiga som pyruvatransport.

den konstanta närvaron av La-och dess ackumulering under perioder med glykolytisk stimulering är bevis på att LDH-reaktionen dominerar över dessa alternativa öden av pyruvat.

Figur 1 illustrerar en modell av intracellulär metabolism som vi kallar ”Cytosol-till-mitokondrier Laktatbuss” ; dess ursprung kan spåras till en översyn av La-metabolism av Stainsby och Brooks (1990). På grund av den höga LDH− aktiviteten och en jämviktskonstant långt i riktning mot La−, La-är alltid det dominerande resultatet av glykolys. Bildandet av La – är dock inte synonymt med La-ackumulering och ökad . Mitokondrier utgör ett handfat för pyruvat och under förhållanden med långsam glykolytisk aktivitet med gott om O2 är oxidation i de flesta celler tillräcklig för att nära matcha produktionen genom glykolys; transmembran la− flux varierar mellan långsam frisättning och långsam upptag med frisättning som det mer typiska tillståndet. På ett sätt som är analogt med kreatinkinas och Fosfokreatinbussen håller LDH pyruvat och La− i jämvikt i hela cellcytosolen. I detta scenario är La-den primära arten som reser till grannskapet i mitokondriell retikulum, troligen till intermembranutrymmet där LDH är fäst vid utsidan av det inre mitokondriella membranet (Hashimoto et al., 2006; Gladden, 2008). Här omvandlas La-till pyruvat för inträde i mitokondrier, med tanke på den relativa ”diskbänken” för pyruvat. Samtidigt regenereras NADH från reverseringen av LDH-reaktionen och dess par elektroner skyttelas över det inre mitokondriella membranet av malat-aspartat och glycerolfosfatbuttlarna. En viktig skillnad från Fosfokreatinbussen är att två nyckelkomponenter, La− och pyruvat, till skillnad från fosfokreatin, kan korsa plasmamembranet och lämna cellen.

Cytosol-till-mitokondria− paradigmet innebär att La− alltid bildas under glykolys, även om La-inte ackumuleras och är stabil. Naturligtvis, om O2 är så låg att oxidativ fosforylering hämmas, kommer La− produktionen att överstiga den hastighet med vilken oxidativ metabolism kan använda pyruvat och NADH, vilket orsakar och La− efflux att stiga. Om glykolytisk aktivitet ökar även med rikliga O2-nivåer, som vid skelettmuskelkontraktion vid måttlig intensitet eller kanske i aktiverade astrocyter (Pellerin och Magistretti, 2011), kommer La− produktionen inte att matchas av pyruvatoxidation och kommer att stiga som kommer transport av La− ut ur cellen. På liknande sätt, om glykolytisk enzymaktivitet förbättras och/eller mitokondriell funktion (oxidativ enzymaktivitet) nedregleras så att glykolys gynnas över oxidation, kommer det att finnas en pågående obalans mellan La− produktion och efterföljande pyruvat− och NADH-oxidation vilket resulterar i förhöjd och La-efflux. Denna senare situation observeras i” Warburg ” cancerceller (Semenza, 2008) och hos KOL-patienter under helkroppsövning in vivo (Maltais et al., 1996).

med uthållighetsträning ökar skelettmuskelns mitokondriella innehåll (Holloszy och Coyle, 1984), och det finns nu ett större handfat för pyruvat. Ökad mitokondriell oxidativ aktivitet kräver lägre nivåer av stimulatorer (t.ex. ADP) för en viss oxidativ fosforyleringshastighet; samma stimuli är allosteriska stimulatorer av viktiga glykolytiska enzymer så glykolys reduceras. Dessutom, om La-membrantransport hämmas, särskilt i celler som redan har en obalans där glykolys gynnas över oxidativ metabolism, är det troligt att cellulär kommer att stiga med potentiellt skadliga effekter på cellen (Le Floch et al., 2011). Vidare bör stark hämning av total LDH− aktivitet i glykolytiska celler förhindra jämvikt och därigenom minska La-produktion, ackumulering och utflöde (Fantin et al., 2006). Effekten av att ändra LDH-isozymmönstret oberoende av hämning eller minskning av total LDH-aktivitet är dock ännu inte helt löst (Downer et al., 2006).

framtida riktningar: påverkan av LDH-Isoform och tillämpningar på Tumörmetabolism

vilken inverkan har LDH-isoform och hur kan denna kunskap tillämpas på behandling av sjukdomar med förändrad metabolism, som cancer?

först är LDH ett tetrameriskt enzym som består av två proteinunderenheter som totalt cirka 135 kDa (Cahn et al., 1962). Tetrameren kan samlas som fem separata isozymer genom att bilda alla kombinationer av m (muskel) form (produkt av LDH-a-genen) eller h (hjärta) form (produkt av LDH-B-genen) som producerar: M4 (=A4 = LDH5), M3H1 (=A3B1 = LDH4), M2H2 (=A2B2 = LDH3), M1H3 (=A1B3 = LDH2) och H4 (=B4 = LDH1). Resultat från undersökningar in vitro indikerar olika kinetiska egenskaper med avseende på substrataffinitet och hämning bland dessa isozymer. De m-dominerade isozymerna har 3,5-7 gånger högre Km-värden för pyruvat och La− än de h-dominerade formerna. Vidare hämmas H4-typerna av pyruvat vid koncentrationer över ~0,2 mM medan M4-typerna påverkas lite av pyruvatkoncentrationer så höga som 5 mM (Plagemann et al., 1960; Stambaugh och Post, 1966; Quistorff och Grunnet, 2011b). H4-isozymet hämmas av över 20-40 mM medan M4-isozymet hämmas mindre av high (Stambaugh och Post, 1966). Dessa punkter har erbjudits som bevis för funktionella skillnader i cellulär metabolism av olika vävnader med hjärtformerna som främjar oxidation medan muskelformerna underlättar bildandet av La− (Cahn et al., 1962). LDH-isozymfördelningen som finns i naturen passar med dessa egenskaper bestämda in vitro. Till exempel har snabb-twitch, glycolytic, typ II skelettmuskelfibrer en större andel av M-typ LDH isozym medan långsam-twitch, oxidativ, typ i skelettmuskler samt hjärtmuskel har en större andel av H-typ LDH isozym (Van Hall, 2000). Kongruent minskar uthållighetsträning andelen M-typ LDH-isozym i de tränade musklerna (Van Hall, 2000). I hjärnan har astrocyter (som postuleras för att ha en högre glykolytisk metabolism) en större andel av M-typen LDH-isozymet, medan neuroner (som påstås ha en högre oxidativ metabolism) har en större andel av H-typen LDH-isozymet (Schurr, 2006; Pellerin och Magistretti, 2011). I tumörer har glykolytiska” Warburg-typ ” – celler en större andel m-typ LDH-isozym medan mer oxidativa cancerceller har en större andel H-typ LDH-isozym (Semenza, 2008). Så sammanfaller de omständliga bevisen på LDH-isozymfördelningsmönster med den upplevda funktionen hos LDH-isozymerna som bestämda in vitro.

bevisen ovan har lett till slutsatsen att LDH− isozymmönster är en orsakande faktor i La-metabolism. För att ytterligare belysa rollen som LDH− isozymefördelning som koordinator för La-metabolism, Summermatter et al. (2013) genomförde en undersökning för att testa rollen som peroxisomproliferatoraktiverad receptor-kubikoaktivator 1 Kubi (PGC-1 Kubi) som regulator för LDH-isozym-subtyputtryck. PGC-1 är känt för att vara viktigt i samordningen av cellulär energimetabolism (Wu et al., 1999). Som svar på en mängd olika stimuli stimulerar PGC-1 megapixlar mitokondriell biogenes, främjar övergången av skelettmuskel till en mer oxidativ fenotyp och bidrar till förändrad kolhydrat-och lipidmetabolism (Liang and Ward, 2006).

Summermatter et al. (2013) studerade muskelspecifika PGC-1-transgena möss samt muskelspecifika PGC-1-knockout-möss och fann (1) lägre blod i de transgena djuren och högre blod i knockout-djuren som svar på uthållighetsträning, och (2) minskat uttryck av M-typ LDH hos de transgena djuren och minskad H-typ LDH hos knockout-djuren. Dessa författare drog slutsatsen, som deras titel hävdar, att ” skelettmuskulaturen PGC – 1 Audrey kontrollerar hela kroppen La-homeostas genom östrogenrelaterad receptor− beroende aktivering av LDH B och förtryck av LDH A.”Enligt deras uppfattning är LDH-isozymmönstret en viktig aktör i hela kroppens ämnesomsättning av La -.

det finns emellertid undervärderade förmaningar angående LDH-isozymfunktioner och deras potentiella roller i ämnesomsättningen. För det första bestämdes de ovannämnda kinetiska egenskaperna för LDH-isoformer in vitro vid 20 eller 25 kg C, och Km-värdena för pyruvat ökar med temperaturen, ungefär fördubbling vid 37 kg C jämfört med 25 kg c (Latner et al., 1966; Quistorff och Grunnet, 2011b). Tidigare har Newsholme och Leech (1983), Van Hall (2000), Newsholme (2004), Gladden (2008) och Quistorff och Grunnet (2011a) väckt betydande frågor om rollen som LDH− isozymprofiler i La-produktion vs. utnyttjande och noterar att: (1) enzymer ändrar inte jämviktskonstanten för en reaktion; (2) LDH-reaktionen är nära jämvikt, vilket minimerar allosteriska effekter; (3) skillnader i LDH isozymfunktionen in vivo är möjligen ganska liten på grund av de högre fysiologiska temperaturerna och bindningen till strukturer eller andra proteiner; (4) koncentrationerna av La− och pyruvat som behövs för LDH-hämning in vitro är mycket högre än de högsta koncentrationerna som observerats in vivo; och (5) LDH-hämning in vitro kan bero på spår av enolformen av pyruvat som är mindre benägna att förekomma in vivo.

Även om Summermatter et al. (2013) tillstånd med övertygelse om att LDH isoform mönster är en viktig faktor i hela kroppen La− metabolism, det finns en dödlig brist i deras design. De ignorerade det faktum att PGC-1 ci transgena möss har ökat mitokondriell proliferation och oxidativa fosforyleringsenzymer, medan PGC-1 ci knockout-möss har signifikanta minskningar av cytokromoxidas och citratsyntas aktiviteter (Arany et al., 2005). Enligt vår åsikt gör dessa förändringar i mitokondriell funktion, den tidigare noterade höga totala LDH-aktiviteten oavsett isozymmönster, och den nära jämviktskaraktären hos denna reaktion slutsatserna från Summermatter et al. (2013) ohållbar. Därför drar vi slutsatsen att de exakta fysiologiska och biokemiska rollerna för LDH-isozymer in vivo återstår att slutgiltigt klargöras.slutligen, när det gäller tumörmetabolism, är förståelse för att La− är slutprodukten av glykolys avgörande för att utforma interventioner för att rikta cancer. Kortfattat experiment av Cori och Cori (1925) och av Warburg et al. (1927) visade att tumörer verkade glupskt konsumera glukos och producera La−. Efterföljande dogma i tumörmetabolism har hävdat att tumörer uppvisar en” Warburg−effekt”, som producerar och exporterar La -. Men vi vet nu att inte bara olika tumörtyper hanterar La-annorlunda (vissa är nettoproducenter; vissa är nettokonsumenter), men även inom en enda tumör kan det finnas skytteltrafik mellan olika celltyper; en cell till cell La− shuttle (Semenza, 2008). Många cancerceller är dåliga konsumenter av laktat (Sonveaux et al., 2008) gnistor spekulationer om att A La-skyddad hypoglykemi kan vara terapeutisk (Nijsten och van Dam, 2009). Däremot använder vissa tumörer ivrigt La− som bränsle och svarar på kompletterande La-med ökad proliferation och vaskularitet, sannolikt ett direkt resultat av uppreglering av vaskulär endotelväxtfaktor (VEGF) och hypoxiinducerbar faktor 1 kg (HIF-1 kg). I en nyligen genomförd studie om en djurmodell av sarkom, Goodwin et al. (2014) rapporterade att La− körde sarkomagenes i frånvaro av hypoxi. Otroligt, vår förståelse av La− metabolism i cancer förblir orolig nästan 90 år efter Warburgs första studier.

slutsatser

vår förståelse av La-formation har förändrats drastiskt sedan dess upptäckt. Traditionellt har pyruvat ansetts vara slutprodukten av glykolys när O2 är närvarande och La− slutprodukten under perioder med dysoxi. I slutet av nittonhundratalet och början av tjugoförsta århundradet upptäcktes att O2 inte begränsar oxidativ fosforylering under de flesta cellulära förhållanden, och La− produceras verkligen även när det inte finns någon begränsning av graden av O2-leverans till mitokondrier. Ytterligare reflektion över aktiviteten hos LDH-enzymet och jämviktskonstanten i dess reaktion främjar förslaget att La− är den primära slutprodukten av glykolys under de flesta, om inte alla metaboliska tillstånd i de flesta celler. Rollen för de olika LDH-isozymerna i ämnesomsättningen är inte så tydlig som de flesta forskare föreslår, och vi drar slutsatsen att deras exakta funktion förblir oupptäckt. Huruvida vi är korrekta om Cytosol-till-mitokondrier Laktatfärjan som beskrivs här och den osäkra rollen för LDH-isoformerna kommer att vara svår att utvärdera under förhållanden in vivo. Ett tillvägagångssätt är modellering i silico. Att förstå de exakta mekanismerna för glykolys och La-metabolism kommer inte bara att fördjupa vår förståelse av metabolism i friska vävnader, men kommer också att ge insikt i sjuka eller skadade vävnader, med de mest uppenbara applikationerna som den rubbade kolhydratmetabolismen som finns i cancerceller (Vander Heiden et al., 2009) och cerebral metabolism efter traumatisk hjärnskada (Brooks och Martin, 2014).

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.