Gasteyer utvecklade komediupplevelse med Los Angeles improvisationsskiss komedi grupp The Groundlings. Hon spelade små roller på Seinfeld (som en dömd kund av Soup Nazi), liksom på showen Party of Five, Frasier, Hope & Gloria och NYPD Blue. 1996 gick Gasteyer med i rollerna i Saturday Night Live. Bland hennes mest populära karaktärer var high school musiklärare Bobbie Mohan-Culp, National Public Radio Delicious Dish värd Margaret Jo McCullen, Lilith Fair feministisk sångare Cinder Calhoun, och hennes intryck av Martha Stewart och Celine Dion. År 2000 provspelade hon och Chris Parnell för att lyckas Colin Quinn som medankare av nyhetsparodisegmentet Weekend Update, men positionerna gick slutligen till Tina Fey och Jimmy Fallon.efter sex säsonger lämnade Gasteyer SNL 2002. Därefter uppträdde hon i olika tv-program, filmer och scenproduktioner. År 2004 spelade Gasteyer moderen till huvudpersonen Cady Heron (Lindsay Lohan) i spelfilmen Mean Girls, skriven av SNL castmate Tina Fey. Filmen innehöll också andra tidigare SNL-castmates, inklusive Fey, Tim Meadows och Amy Poehler. Hon medverkade också i 2005 Showtime film musikaliska Reefer Madness som Mae, den dömda flickvän Jack och ägare av Reefer Den.
Gasteyer spelade i en återupplivning av Threepenny Opera på Broadway som FRU Peachum, tillsammans med Jim Dale, Alan Cumming och Cyndi Lauper. Produktionen pågick från 24 mars till 25 juni 2006.
den 24 juni 2005, Gasteyer har sitt ursprung i rollen som Elphaba i Chicago sit-down produktion av musikalen Wicked, tillsammans med Kate Reinders som Glinda. Produktionen öppnade 13 juli 2005. Gasteyer nominerades till en Jefferson Award för sin prestation. Hon spelade sin sista prestation den 22 januari 2006, ersatt av hennes standby Kristy Cates. Hon repriserade senare rollen i Broadway-produktionen från 10 oktober 2006 till 7 januari 2007 och ersatte Eden Espinosa.
den 12 April 2007 meddelade media att Gasteyer hade gått med i rollen i den då nya musikalen, Writing Arthur, för 2007 New Works Festival for TheatreWorks i Kalifornien, som pågick från 14 April till 22 April. Gasteyer uppträdde i Chicago i Stephen Sondheim musical Passion på Chicago Shakespeare Theatre från 2 oktober 2007 till 11 November 2007.
hon spelades ursprungligen som Gloria i Encores! Sommar serieproduktion av Damn Yankees, men på grund av skada under repetitioner ersattes hon av Megan Lawrence. Gasteyer deltog i läsningen av Broadway musikaliska versionen av First Wives Club.
hon spelade som Kitty Dean i Broadway-pjäsen, Den kungliga familjen som började framträdanden på Samuel J. Friedman Theatre den 15 September 2009 och öppnade officiellt den 8 oktober 2009. Showen avslutade sin körning den 13 December 2009. Gasteyer spelade också rollen som Frisco Kate Fothergill i stadens centrum Encores! produktion av Girl Crazy, som löper från 19 November till 22 November 2009.
hon återvände till Saturday Night Live för en speciell mors dag episod den 8 maj 2010 och för en annan Mors dag episod den 11 maj 2012.
Gasteyer dök upp i säsong åtta av Curb Your Enthusiasm som Larry Davids flickvän.
från 2011 till 2014 spelade Gasteyer som Sheila Shay i ABC-komedieserien Suburgatory, och från och med mars 2013 var hon taleskvinna för Weight Watchers diet plan.under 2014 utnyttjade Gasteyer sin utbildning som sångare och spelade in och släppte I ’ m Hip, ett album med jazzstandarder. ”One Mint Julep” var ett av de val som den inkluderade. År 2015 spelade hon Mimi Schwinn i New York City Center Encores! Off-Broadway återupplivning av musikalen A New Brain, som också visas på den gjutna inspelningen.
från 2016 till 2017 hade Gasteyer en huvudroll på TBS kult hit people of Earth, som ledare för en främmande bortförd stödgrupp.
i oktober 2019 släppte hon semesteralbumet socker & sprit. Gasteyer framträdde senare som tävlande på den andra säsongen av The Masked Singer under sken av ”The Tree”, som slutligen avslutade tävlingen på sjätte plats.
i februari 2020 kommer Gasteyer att spela rollen som Katherine Hastings i NBC komedi pilot American Auto som skrevs av Justin Spitzer. I September och oktober 2020 uttryckte hon en röd panda som heter Nut i en vuxen animerad serie med titeln Magical Girl Friendship Squad.