aby wykorzystać moc celowanych endonukleaz macierzystych, Laboratorium Jerome pracowało nad optymalizacją użytecznego systemu dostarczania zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro. Wykorzystali system dostarczania wirusa adeno-associated (AAV) do kierowania zwojów trójdzielnych myszy z jedną z dwóch endonukleaz specyficznych dla HSV: hsv1m5, który jest przeznaczony do rozszczepiania genu białka wirionu VP5, i HS1m8 ,który jest skierowany na gen kodujący podjednostkę katalityczną polimerazy DNA. Tworzenie mutacji w jednym z tych genów powoduje zaburzenie genomu wirusa i zapobiega produkcji wirionu. W celu dalszego zwiększenia efektów leczenia Trex-2, Ko-transdukowano endonukleazę 3′-5′, która, jak wykazano, zwiększa ukierunkowaną mutagenezę. Po ustaleniu systemu laboratorium rozpoczęło prace in vitro skupiające się na neuronach, biologicznie istotnym typie komórek. Kultury neuronów współwystępowały z HSV1m5 lub 8 i Trex-2, a następnie zakażono HSV. Leczone Kultury wykazały 50% zmniejszenie miana wirusa, jak również obecność mutacji w HSV w teście T7 endonukleazy 1 i sekwencjonowaniu klonalnym. Po zakłóceniu zakażenia litycznego ustalono, że naukowcy zaczęli przyglądać się wpływom na różne stadia zakażenia HSV. Wykorzystując zakażone Kultury neuronów z HSV, a następnie leczonych Hsv1m5 lub 8 z Trex-2 w różnych punktach czasowych, naukowcy mogli symulować różne etapy infekcji. Leczono hodowle po 7 dniach (faza ostra), 14 dniach (Faza późna ostra/ wczesna faza utajona) i 32 dniach (Faza utajona) i nie stwierdzono zmian w działaniu niezależnie od fazy wirusowej. Sugeruje to, że HSV jest podobnie podatny na mutagenezę endonukleazy, niezależnie od fazy wirusowej. Poziomy mutacji w miejscu docelowym wahały się od 4,5-7,6% i 1,1-6,6% odpowiednio dla HSV1m5 i HSV1m8. Obecnie jest to pierwsze badanie dotyczące aktywności endonukleazy w neuronach zakażonych latentnie.
zachęceni wynikami in vitro naukowcy przeprowadzili badania in vivo z użyciem myszy zakażonych HSV, a następnie 32 dni później wstrzyknięto AAV (z ekspresją hsv1m5 lub 8 i Trex-2). Neurony myszy pobrano 30 dni po wstrzyknięciu AAV pod kątem miana wirusa, miana wirusa i mutacji genomu HSV. Grupa wykazała 1-2% mutacji u 2/4 myszy dla HSV1m5 i u 3/4 myszy dla hsv1m8. Jednak miano wirusa u tych zwierząt było podobne w grupie kontrolnej i leczonych. Wirusowe wydalanie wirusa było opóźnione o jeden dzień u leczonych zwierząt, ale osiągnęło z czasem podobny poziom w porównaniu do nieleczonych. Po zastanowieniu się nad wynikami, Dr Jerome powiedział: „po raz pierwszy u zwierzęcia stwierdzono prawdziwą utajoną infekcję wirusową, a następnie wyłączono, nawet częściowo, za pomocą terapii endonukleazowej. Jest to więc krytyczny krok w kierunku wprowadzenia takich terapii do stosowania u ludzi. Głównym wyzwaniem jest teraz zwiększenie siły terapii, tak aby cały lub prawie cały utajony wirus był genetycznie wyłączony. Badamy nowsze, bardziej wydajne nukleazy, takie jak CRISPR / Cas, i oceniamy nowe metody dostarczania nukleaz do zakażonych neuronów in vivo.”W przyszłości terapia ta może prowadzić do nowego sposobu myślenia o leczeniu utajonych chorób, takich jak HSV i HIV, które obecnie uważamy za nieuleczalne.
finansowanie tych badań zapewniły National Institutes of Health oraz Canadian Foundation.
Aubert M,Madden EA,Loprieno m,DeSilva Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret a,Galleto R,Stone d,Jerome KR. 2016. In vivo zakłócenie utajonego HSV przez projektowaną terapię endonukleazową. JCI Insight, 1(14).