| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein struktury: | Pfam | PDB | pdbsum | |||
TAQ pola ma ogólną strukturę podobną do E. coli pola. Środkowa domena egzonukleazy 3′-5′ odpowiedzialna za korektę została radykalnie zmieniona i nie działa. Posiada funkcjonalną domenę egzonukleazy 5 ’ -3 ’ na końcu aminowym, opisaną poniżej. Pozostałe dwie domeny działają w koordynacji, poprzez sprzężony ruch domeny.
Egzonukleaza Domainedit
egzonukleaza polimerazy Taq jest domeną znajdującą się w amino-terminalu polimerazy DNA TAQ i (termostabilnej). Zakłada motyw rybonukleazy podobny do H. Domena nadaje polimerazie aktywność egzonukleazy 5 ’-3′.
w przeciwieństwie do tej samej domeny w E. coli, która degradowałaby startery i musiałaby zostać usunięta przez trawienie w celu zastosowania PCR, domena ta nie degraduje startera. Aktywność ta jest wykorzystywana w sondzie TaqMan: gdy nitki potomne są tworzone, sondy komplementarne do szablonu wchodzą w kontakt z polimerazą i są rozszczepiane na fluorescencyjne kawałki.
wiązanie z DNAEdit
polimeraza Taq wiąże się w miejscu aktywnym polimerazy z tępym końcem dupleksowego DNA. Ponieważ polimeraza Taq jest w kontakcie ze związanym DNA, jej łańcuchy boczne tworzą wiązania wodorowe z purynami i pirymidynami DNA. Ten sam region polimerazy Taq, który wiąże się z DNA, wiąże się również z egzonukleazą. Struktury te związane z polimerazą Taq mają różne interakcje.
MutantsEdit
opisano eksperyment mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, który poprawia pozostałą aktywność egzonukleazy 3′-5′ o czynnik 2, ale nigdy nie zgłoszono, czy w ten sposób zmniejsza się współczynnik błędu. Zgodnie z podobną linią myślenia, białka Chimery zostały wytworzone przez domeny zbierające wiśnie z E. coli, Taq i T. neapolitana polimeraza I. Zamiana domeny szczątkowej na funkcjonalną z E. coli stworzyła białko o zdolności odczytu, ale o niższej optymalnej temperaturze i niskiej termostabilności.
wyprodukowano wersje polimerazy bez domeny egzonukleazy 5′-3′, wśród których najbardziej znane są Klentaq lub fragment Stoffela. Całkowity brak aktywności egzonukleazy sprawia, że te warianty nadają się do starterów, które wykazują strukturę drugorzędową, jak również do kopiowania cząsteczek okrągłych. Inne odmiany obejmują stosowanie Klentaq z polimerazą o wysokiej wierności, Termosekwenazą, która rozpoznaje substraty, takie jak polimeraza DNA T7, mutanty o wyższej tolerancji na inhibitory lub wersje „oznaczone domeną”, które mają dodatkowy motyw helisy-spinki do włosów-helisy wokół miejsca katalitycznego, aby mocniej trzymać DNA pomimo niekorzystnych warunków.
znaczenie w wykrywaniu chorobuedit
ze względu na poprawę polimerazy Taq zapewnianą w replikacji DNA PCR: wyższa specyficzność, mniej niespecyficznych produktów oraz prostsze procesy i sprzęt, odegrały kluczową rolę w wysiłkach podejmowanych w celu wykrycia chorób. „Zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w diagnostyce chorób zakaźnych, zaowocowało zdolnością do wczesnego diagnozowania i odpowiedniego leczenia chorób z powodu wybrednych patogenów, określenia wrażliwości przeciwbakteryjnej wolno rosnących organizmów i ustalenia kwantu infekcji.”Wdrożenie polimerazy Taq uratowało niezliczoną ilość istnień ludzkich. Odegrał istotną rolę w wykrywaniu wielu najgorszych chorób na świecie, w tym: gruźlicy, paciorkowcowego zapalenia gardła, atypowego zapalenia płuc, AIDS, odry, zapalenia wątroby i wrzodziejących infekcji układu moczowo-płciowego. PCR, metoda używana do odtwarzania kopii konkretnych próbek DNA, umożliwia wykrywanie choroby poprzez ukierunkowanie określonej sekwencji DNA patogenu docelowego z próbki pacjenta i amplifikację śladowych ilości sekwencji orientacyjnych poprzez kopiowanie ich do miliardów razy. Chociaż jest to najdokładniejsza metoda wykrywania chorób, zwłaszcza w przypadku HIV, nie jest wykonywana tak często, jak alternatywne, gorsze testy ze względu na stosunkowo wysokie koszty, robociznę i wymagany czas.
zależność od polimerazy Taq jako katalizatora procesu replikacji PCR została podkreślona podczas pandemii COVID-19 w 2020 roku. Niedobory niezbędnego enzymu osłabiły zdolność krajów na całym świecie do produkcji zestawów testowych na obecność wirusa. Bez polimerazy Taq proces wykrywania choroby jest znacznie wolniejszy i żmudny.
pomimo zalet stosowania polimerazy Taq w wykrywaniu choroby PCR, enzym nie jest pozbawiony swoich wad. Choroby retrowirusowe: HIV, HTLV-1 i HTLV-II; często zawierają mutacje od guaniny do adeniny w swoim genomie. Mutacje takie jak te są tym, co pozwala PCR testy wykryć choroby, ale Taq polimerazy stosunkowo niski wskaźnik wierności sprawia, że ten sam G-to-a mutacja występuje i ewentualnie dają fałszywie dodatni wynik testu.