1 Theory
Oligonucleotides are synthesized by the adding of one base at a time, extended from the 3′ to the 5′-end, attached to a solid-phase support. Po zakończeniu syntezy chemicznej oligonukleotydu łańcuch DNA jest uwalniany ze stałego nośnika przez inkubację z wodorotlenkiem amonu. Amon działa również jako środek deprotekcyjny, odcinając grupy chroniące fosforany w wiązaniach fosfodiestrowych. Następnie dodaje się gorący amoniak w celu hydrolizy grup ochronnych z egzocyklicznych grup aminowych deoksyadenozyny, deoksycytozyny i deoksyguanozyny. Oligonukleotyd można dostarczyć użytkownikowi w roztworze amoniaku jako surowy preparat. W takim przypadku przed użyciem może być konieczne przeprowadzenie dodatkowego etapu w celu usunięcia soli i produktów ubocznych z preparatu oligonukleotydowego wytworzonego podczas usuwania.
Po deprotekcji preparat oligonukleotydowy jest zwykle odsalany, oznaczany ilościowo, odparowywany do suchości w liofilizatorze i dostarczany użytkownikowi w postaci proszku. Odsolony roztwór oligonukleotydu zawiera oligonukleotyd o Pełnej długości, ale zawiera również mieszaninę obciętych produktów, które zostały nagromadzone podczas syntezy chemicznej. Obcinanie występuje, gdy określona baza nie dodaje się do łańcucha w odpowiednim cyklu (Hecker & Rill, 1998). Tak więc procent produktów ściętych zgromadzonych w preparacie jest określany przez wydajność syntezy (frakcję produktu pełnowymiarowego po syntezie) i długość cząsteczki. Długie oligonukleotydy, które wymagają więcej cykli do syntezy, są mniej czyste niż krótkie oligonukleotydy. Awarie te mogą konkurować z produktem o Pełnej długości w niektórych zastosowaniach i mogą wymagać usunięcia przed użyciem oligonukleotydu. Jednakże odsalone preparaty oligonukleotydowe są zwykle odpowiednie do wielu zastosowań, takich jak standardowe PCR lub mikromacierze, zwłaszcza jeśli oligonukleotyd ma długość < 20 nukleotydów.
zaleca się dalsze oczyszczanie oligonukleotydów dłuższych niż 50 zasad, ponieważ procent pełnowartościowego produktu w preparacie zwykle nie przekracza 80%. W wymagających zastosowaniach, w których dokładna długość oligonukleotydu jest ważna, takich jak testy z przesunięciem żelowym, mutageneza ukierunkowana na miejsce, sekwencjonowanie, produkcja adapterów klonujących lub synteza cDNA pierwszej nici do generowania bibliotek, zalecane jest dodatkowe oczyszczanie, nawet w przypadku krótszych oligonukleotydów (patrz więcej informacji na temat powyższych technik w standardowych testach in vitro dla interakcji białko-kwas nukleinowy-testy z przesunięciem żelowym dla wiązania RNA i DNA oraz mutageneza ukierunkowana na miejsce).
oczyszczanie może być wymagane po syntezie lub po enzymatycznej modyfikacji oligonukleotydu. Istnieje kilka metod osiągnięcia tego celu, a wybór zależy od charakteru oligonukleotydu i zastosowania, do którego jest przeznaczony.
odwrócona Faza oczyszczania HPLC opiera się na hydrofobowości. Wykorzystuje niepolarną fazę stacjonarną, a bufory wodne i rozpuszczalniki organiczne jako fazę ruchomą do elucji analitów; związki polarne są eluowane najpierw, podczas gdy związki niepolarne są zatrzymywane. Jest to najlepsza metoda oczyszczania oligonukleotydów modyfikowanych grupą hydrofobową, taką jak biotyna, fluorescencyjne etykiety barwników lub koniugacje estrowe NHS. Odzysk masy jest wyższy niż przy użyciu oczyszczania strony i jest podatny na oczyszczanie większych ilości oligonukleotydów (skala mmole), chociaż nie usuwa tak skutecznie niekompletnych produktów. Wkłady do oczyszczania oligonukleotydów, oparte na chromatografii odwróconej fazy, zapewniają szybką metodę odsalania i oczyszczania oligonukleotydów.
elektroforeza w żelu Poliakryloamidowym (PAGE) rozwiązuje oligonukleotydy zgodnie z ich długością, a tym samym oferuje wystarczającą rozdzielczość, aby odróżnić produkty pełnej długości od nieudanych cząsteczek (Atkinson and Smith, 1984). Żele poliakrylamidowe są bardziej skuteczne w oddzielaniu małych fragmentów DNA niż żele agarozowe (patrz Analiza RNA za pomocą analitycznej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i elektroforezy w żelu agarozowym). Jedyną wadą żeli poliakrylamidowych jest to, że są trudniejsze do przygotowania i obsługi niż żele agarozowe. Żele poliakrylamidowe są prowadzone w układzie pionowym w stałym polu elektrycznym. Po elektroforezie oligonukleotyd jest eluowany z żelu i zatężany, stosując wytrącanie etanolu (więcej na temat wytrącania kwasów nukleinowych w metodach oczyszczania RNA – wytrącania) lub chromatografię odwróconej fazy. Jest to metoda z wyboru, gdy najwyższy procent oligonukleotydów pełnej długości jest pożądany w wymagających zastosowaniach. Jest również zdecydowanie zalecany do oligonukleotydów dłuższych niż 30 zasad. Ponadto kilka próbek może być uruchamianych jednocześnie i nie jest wymagany drogi sprzęt. Jedyną wadą tej techniki jest niewielka ilość oligonukleotydu otrzymywana na oczyszczanie. Zazwyczaj stosuje się oligonukleotydy w skali 1 µmol lub mniejszej, a odzyskiwanie masy po oczyszczeniu strony wynosi < 50%, a nawet mniej w przypadku zmodyfikowanych oligonukleotydów. Niemniej jednak, chociaż wydajność jest niska, jest zadowalająca dla większości zastosowań biochemicznych.
preparat oligonukleotydowy ładuje się na denaturujący żel poliakrylamidowy w ilości co najmniej 1 mg na pas. Zakres rozdzielczości żelu zależy od stężenia poliakrylamidu. W przypadku krótkich oligonukleotydów (od 15 do 35 zasad) zaleca się 13-15% żeli poliakrylamidowych; w przypadku dłuższych oligonukleotydów (od 35 do 70 zasad) zaleca się 8-13% żeli poliakrylamidowych. Zawartość procentowa żelu powinna być dostosowana do systemu biegowego. Zwykle używamy systemu Bio-Rad Mini Protean II i stosujemy 15% żeli do oczyszczania oligonukleotydów o długości 25 zasad. Po identyfikacji właściwej opaski za pomocą wizualizacji UV opaska jest wycinana i ekstrahowana z żelu.
w tym rozdziale opisano dwie różne metody oczyszczania oligonukleotydów z żeli poliakryloamidowych. Najprostszą metodą jest elucja za pomocą dyfuzji. Opiera się to na ruchu cząsteczek z regionu o wyższym stężeniu do regionu o niższym stężeniu. Wynikiem dyfuzji jest stopniowe mieszanie materiału. Ta metoda jest czasochłonna, ale nie wymaga zbyt wiele pracy ani żadnego sprzętu. Zasadniczo pasmo poliakrylamidowe zawierające interesujący oligonukleotyd jest pokrojone na małe kawałki i pokryte buforem elucyjnym. Po inkubacji DNA jest oczyszczane z supernatantu przez wytrącanie etanolu. Wydajność jest ograniczona, między 20% a 70%, w zależności od długości oligonukleotydu. Im większa ilość użytego buforu elucyjnego, tym więcej oligonukleotydu jest rozpraszane z żelu.
drugą metodą jest elektroelucja do worka do dializy (McDonell et al., 1977). Kawałek żelu zawierający oligonukleotyd jest wycinany i umieszczany w worku do dializy z buforem. Zastosowanie prądu elektrycznego powoduje migrację DNA z żelu do bufora worka do dializy. Oligonukleotyd jest odzyskiwany z tego buforu i oczyszczany. Stosując tę metodę, oligonukleotyd można wyizolować z dobrą wydajnością, chociaż jest to czasochłonne, jeśli duża liczba próbek jest oczyszczana w tym samym czasie, ponieważ wymaga wprowadzenia każdego pasma żelu do poszczególnych worków do dializy. Metoda ta działa również dobrze w przypadku większych fragmentów DNA, a nawet może być stosowana do ekstrakcji DNA z żeli agarozowych.