Identification of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa in Blood Cultures: Wieloośrodkowa ocena działania trójkolorowego testu fluorescencji kwasu nukleinowego In Situ hybrydyzacji

tekst

Gram-ujemne prątki (GNB) są związane z infekcjami krwiobiegu (BSI), co prowadzi do istotnej śmiertelności, szczególnie u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii (ICU). Wśród najbardziej rozpowszechnionych patogenów GNB są Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Pseudomonas aeruginosa (4, 8). Wybór empirycznej terapii zakażeń GNB jest trudny ze względu na wrodzoną oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe wśród wielu P. szczepy aeruginosa i pojawiająca się oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe karbapenemu wśród izolatów K. pneumoniae. Szybka identyfikacja patogenu tego samego dnia bezpośrednio z nowo dodatnich butelek do hodowli krwi może mieć wpływ na odpowiedni dobór terapii empirycznej, która jest ważnym czynnikiem poprawiającym wyniki leczenia pacjentów (7). Testy fluorescencji kwasu nukleinowego in situ (pna FISH) (AdvanDx Inc.) wykazano korzystne porównanie z automatycznymi fenotypowymi metodami ID i mogą dawać wyniki w około 90 minut (10). Ograniczenie obecnych FDA-cleared GNB pna Fish assays (E. coli /P. aeruginosa pna FISH i E. coli, K. pneumoniae / P. aeruginosa pna FISH) to niezdolność do odróżnienia E. coli od K. pneumoniae. To wieloośrodkowe badanie oceniało skuteczność GNR (gram-ujemny pręt) Traffic Light pna FISH (Nie zatwierdzonej przez FDA w czasie tego badania), pierwszego szybkiego testu pna Fish w celu identyfikacji 3 głównych GNB (E. coli, K. pneumoniae i P. aeruginosa) bezpośrednio z nowo dodatnich kultur krwi.

w czterech amerykańskich ośrodkach badawczych pobrano posiewy krwi z dodatnim wynikiem badania GNB. Metoda phenotypic ID dla każdego laboratorium została przeprowadzona przy użyciu Microcan (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) lub VITEK2 (bioMérieux, Inc., Durham, NC). Dane zebrane do tego badania nie zawierały identyfikatorów pacjentów i wykorzystano jedynie posiewy krwi pobrane do celów klinicznych. Institutional Review Board (IRB) uzyskano zatwierdzenie lub zwolnienie dla protokołu badania od każdej instytucji. W każdym miejscu zastosowano jeden z następujących trzech zautomatyzowanych, stale monitorujących systemów hodowli krwi: BacT / Alert (bioMérieux, Inc., Durham, NC), BACTEC (BD Diagnostics, Spark, MD), czy VersaTrek (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH). Dla każdej próbki przeprowadzono badanie GNR Traffic Light pna FISH, zgodnie z zaleceniami producenta. Szkiełka zbadano mikroskopią fluorescencyjną (60× lub 100× cel olejowy, Dwuzakresowy izotiocyjanian fluoresceiny / Filtr Texas Red). Wyniki interpretowano jako pozytywne, gdy komórki fluorescencyjne były widoczne w wielu polach widzenia, w następujący sposób: zielony dla E. coli, czerwony dla P. aeruginosa i żółty dla K. pneumoniae. Dodatkowo EK / P. aeruginosa pna Fish przeprowadzono na każdej próbce (dane nie zostały pokazane). GNR Traffic Light pna Fish przeprowadzono jednocześnie z rutynowym identyfikatorem laboratoryjnym na nadmiarze materiału do hodowli krwi. Operator badania pna na rybach w każdym miejscu badania był zaślepiony wynikami rutynowej identyfikacji laboratoryjnej do czasu zakończenia wszystkich badań.

do badania włączono łącznie 490 klinicznych posiewów krwi z wynikiem dodatnim na obecność GNB poprzez barwienie gramami oraz 4 butelki z hodowlą krwi wzbogacone klinicznymi izolatami P. aeruginosa. Zautomatyzowane fenotypowe metody ID zidentyfikowały 537 izolatów, w tym 43 w mieszanych kulturach wzrostu 2 lub więcej organizmów. Spośród zidentyfikowanych organizmów 186 (34,6%) to E. coli, 110 (20,5%) to K. pneumoniae, a 48 (8,9%) to P. aeruginosa. Z 43 mieszanych kultur, 15 zidentyfikowano jako posiadające 2 z GNR Traffic Light pna ryb docelowych organizmów obecnych i dlatego oczekuje się, że wyniki fluorescencji 2. Ryby GNR Traffic Light pna prawidłowo zidentyfikowały 100% (186/186) izolatów E. coli, 99,1% (109/110) izolatów K. pneumoniae i 95,8% (46/48) izolatów P. Izolaty aeruginosa (Tabela 1). Jeden fałszywie ujemny dla K. pneumoniae i dwa fałszywie ujemne dla P. aeruginosa, wszystkie w hodowlach mieszanych, zarejestrowano (Izolaty nie były dostępne do ponownego badania). Zgodnie z etykietą producenta innych testów pna dla ryb, takich jak E. coli/P. aeruginosa dla ryb PNA, granica wykrywalności (LOD) wynosi 105 CFU. W hodowlach mieszanych możliwe jest, że jeden organizm może wyrosnąć drugi, a butelka może sygnalizować dodatni sygnał na automatycznym urządzeniu do hodowli krwi, zanim oba organizmy osiągną ten LOD do testu pna FISH. Swoistość testu wynosiła 98.2% (162/165). Mieszane kultury, które zawierały więcej niż jeden izolat inny niż E. coli, P. aeruginosa lub K. pneumoniae (w sumie 28) były liczone raz w obliczeniach specyficzności, ponieważ można było oczekiwać tylko jednego negatywnego wyniku naraz. Jedna próbka Enterobacter cloacae dała fałszywie dodatni wynik E. coli (zielony) (negatywny po powtórzeniu badania), a jedna próbka Acinetobacter baumannii dała fałszywie dodatni wynik P. aeruginosa (czerwony) (izolat/próbka niedostępna do dodatkowych badań). Kolejny fałszywie dodatni P. aeruginosa (red) wynik wystąpił z próbki zawierającej Acinetobacter radioresistens, Rzadki izolat kliniczny. Analiza publicznie dostępnych sekwencji (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wykazała częściowe podobieństwo sekwencji komplementarnych dla A. radioresistens z sondą pna P. aeruginosa.

wykazano, że niewłaściwa początkowa selekcja antybiotyków i opóźnienia w rozpoczęciu skutecznej terapii przeciwdrobnoustrojowej mają niekorzystny wpływ na śmiertelność pacjentów z GNB BSI (6, 7, 9) i, w przypadku Pseudomonas BSI, były związane z dłuższym pobytem w szpitalu (9). Szybka identyfikacja E. coli, P. aeruginosa lub K. pneumoniae z butelek do hodowli krwi mogą mieć wpływ na decyzje kliniczne, umożliwiając wczesny wybór skutecznej ukierunkowanej terapii przeciwdrobnoustrojowej, a tym samym lepsze wyniki pacjentów i krótszy czas pobytu w szpitalu. Po zidentyfikowaniu gatunku można wybrać schemat terapeutyczny z aktywnością przeciwpseudomonalną, taką jak tobramycyna lub piperacylina-tazobaktam w zakażeniu P. aeruginosa i ceftriakson lub inne odpowiednie leki na bakteriemię E. coli. Wczesna identyfikacja K. pneumoniae w hodowli krwi umożliwiłyby szybkie rozpoczęcie odpowiedniej terapii opartej na wzorze oporności tego organizmu w danej instytucji, takiej jak szybkość przenoszenia β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (ESBL) lub częstość występowania oporności na karbapenem. Wykazano, że wyniki Rapid pna Fish ujemne dla E. coli, P. aeruginosa lub K. pneumoniae wskazują na wzrost prawdopodobieństwa oporności izolatu na cefalosporynę, co dodatkowo wspiera koncepcję rapid patogen ID wpływającą na decyzje terapeutyczne (5).

to badanie wykazało, że GNR Traffic Light pna FISH jest bardzo czułym i specyficznym testem do identyfikacji najczęstszych GNB odzyskiwanych z nowo dodatnich butelek do hodowli krwi. Czas do uzyskania wyników dla ryb GNR Traffic Light pna z dodatniej hodowli krwi wynosi około 90 minut (czas praktycznego technologa wynosi około 10 minut na test), w porównaniu do 1 do 3 dni w przypadku konwencjonalnych metod fenotypowych. Podczas gdy ocena rzeczywistego kosztu wdrożenia GNR Traffic Light pna FISH wykraczała poza zakres tego badania, przybliżony koszt testu w oparciu o cenę katalogową producenta wynosi 39 USD (bez kontroli), a Refundacja Medicare wynosi 84,66 USD. Jak sugerują badania innych testów pna FISH, wydatki laboratoryjne na wdrożenie GNR Traffic Light pna FISH byłyby uzasadnione, gdy mierzone byłyby w stosunku do poprawy wyników pacjentów, zmniejszenia długości pobytów w szpitalu i rozsądnego stosowania terapii przeciwdrobnoustrojowej (1, 2, 3). Bezpośredni wpływ GNR Traffic Light pna FISH na wybór odpowiedniej terapii empirycznej, późniejsze wyniki pacjentów i korzyści kosztowe byłyby obszarami zainteresowania przyszłych badań.