facylitacja ad wywołana Hiperpolaryzacją
najpierw zmierzyliśmy częstość występowania krótkiej hiperpolaryzacji komórki presynaptycznej na transmisji synaptycznej. Pary monosynaptycznie połączonych neuronów CA3 zarejestrowano w kulturach organotypowych hipokampa szczura po 8-10 dniach in vitro (DIV)21. Hiperpolaryzujący impuls 200 ms dostarczony przed skokiem presynaptycznym zwiększał siłę synaptyczną o ∼20% (Fig. 1a). Wzrost ten zaobserwowano przy pomiarze amplitudy lub ładunku odpowiedzi postsynaptycznej (Fig. 1). W tych eksperymentach presynaptyczny potencjał spoczynkowy wynosił -74±3 mV (n=10). H-ADF był porównywalny, gdy hiperpolaryzacja presynaptyczna wynosiła -84 lub -102 mV (odpowiednio, 124±8% wobec 119±5%, n=10; Test Wilcoxona p>0.1), co sugeruje, że hiperpolaryzacja presynaptyczna o wartości ∼10 mV jest wystarczająca do uzyskania nasycającego H-ADF. h-ADF wiązało się ze zmniejszonym stosunkiem parowanych impulsów (PPR, z 99±7 do 88±5%, n=12; test Wilcoxona p<0,05; dodatkowe rys. 1), wskazując, że wynika to ze wzrostu presynaptycznego uwalniania glutaminianu.
(a) ułatwienie transmisji synaptycznej przy połączeniach CA3–CA3 przez hiperpolaryzację impulsu wstępnego (czas trwania 200 ms). Po lewej, schemat konfiguracji nagrania. Środkowy, przykład ułatwiania wytwarzanego przez presynaptyczny impuls hiperpolaryzujący (uśredniono 10 śladów). Racja, podsumowanie ułatwień wywołanych presynaptyczną hiperpolaryzacją rosnącej amplitudy. Zauważ, że nie było dalszych ułatwień, gdy wielkość hiperpolaryzującego pre-pulsu została zwiększona. b) h-ADF może być wywołany przez krótką hiperpolaryzację presynaptyczną. Po lewej, przykłady zapisu z pary połączonych neuronów piramidalnych CA3 bez hiperpolaryzacji i 15, 50, 100 i 200 ms hiperpolaryzacji do -93 mV przed skokiem. Tak, podsumowanie facylitacji wywołanych przez 15, 50, 100 i 200 ms (wszystkie testy Wilcoxona, p< 0,05, N = 7). c) D–I H-ADF są współspresowane przy połączeniach CA3-CA3. Lewa, przykład reprezentatywny. Górne ślady, potencjał błonowy neuronu presynaptycznego w kontroli (Czarny), podczas d-ADF (czerwony), podczas H-ADF (niebieski) i gdy D – I H-ADF są połączone (Ciemny czerwony). Dolne ślady, odpowiedzi postsynaptyczne w każdym przypadku były uśrednione w 10 badaniach. Racja, dane grupowe (test Manna–Whitneya, n=16, dla d-ADF, 11 dla h-ADF i 16 dla d – I h-ADF). Zwróć uwagę na stopniowy wzrost transmisji przy połączeniu d-I H-ADF.
hiperpolaryzacja o długości 200 ms jest mało prawdopodobna w kontekście fizjologicznym. Dlatego zbadaliśmy przebieg h-ADF dla krótszych hiperpolaryzacji (15, 50, 100 i 200 ms). h-ADF obserwowano przez wszystkie okresy przebadanej hiperpolaryzacji (15 ms: 111±3%, 50 ms: 116±4%, 100 ms: 109±4%, 200 ms: 120±6% Wilcoxon, p<0,05 dla wszystkich okresów, N=7, Fig. 1B). Zgodnie z tym wynikiem, h-ADF może być indukowany przez fizjologiczną hiperpolaryzację.
neurony piramidalne CA3 wykazują ekspresję ad facylitacji wywołanej depolaryzacją (d-ADF), która wynika z powolnej inaktywacji kanałów Kv1.1 (stała czasowa: 3,3 s)13. Zbadaliśmy zatem, czy zarówno d -, jak i H–ADF wyrażono w tych samych połączeniach CA3-CA3. Presynaptyczne APs były wyzwalane alternatywnie z potencjału membrany spoczynkowej (Kontrola -78 mV), po długiej depolaryzacji podprzestrzennej (10 s, -62,6 mV, d-ADF), po krótkiej hiperpolaryzacji (200 ms, -96,1 mV, h-ADF) lub po połączeniu długiej depolaryzacji i krótkiej hiperpolaryzacji (D – I H-ADF; Fig. 1c, po lewej). W rzeczywistości połączenie dwóch form ADF spowodowało, w tych samych połączeniach, większe ułatwienie (113±3%, N = 16; Fig. 1c) niż wytwarzany oddzielnie przez każdy protokół (sam d-ADF: 105±3%, n=16, sam H-ADF: 108±4%, N=11; Fig. 1c). Stwierdzono, że uśrednione H-I d-ADF sumują się liniowo, co sugeruje dwa niezależne mechanizmy molekularne. Ponadto D-I H-ADF zmierzone w tych samych parach były dodatnio skorelowane (dodatkowe rys. 1), co sugeruje, że niektóre połączenia synaptyczne są bardziej podatne na adsynaptyczne, prawdopodobnie dlatego, że propagacja sygnału analogowego wzdłuż aksonu zależy od odległości między soma a ZACISKAMI presynaptycznymi. Dane te pokazują, że h – I d-ADF współistnieją w neuronach piramidalnych CA3 i że mechanizmy leżące u ich podstaw mogą być niezależne.
h-ADF obserwowano w młodych neuronach CA3 (DIV8–10 otrzymywanych od szczurów P5–P7), a więc może to wynikać głównie z niskiej gęstości lub niedojrzałych właściwości kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Dlatego ustaliliśmy, czy h-ADF znaleziono również w dojrzałych komórkach piramidalnych CA3. Sparowane nagrania połączonych neuronów CA3 uzyskano w kulturach plastrów DIV24–DIV32. Krótka hiperpolaryzacja presynaptyczna (200 ms) znacznie zwiększyła siłę synaptyczną (104.2±1,1% N=25; Wilcoxon, p<0,01; dodatkowe rys. 2). H-ADF mierzony w dojrzałych komórkach był mniejszy od mierzonego w rozwijających się neuronach (Mann-Whitney, P<0,01; dodatkowe Fig. 2). Wnioskujemy zatem, że h-ADF jest regulowany w neuronach CA3 in vitro.
Wszystkie nagrania uzyskano z wysokim pozakomórkowym wapniem (3 mM) w celu optymalizacji siły synaptycznej. W tych warunkach prawdopodobieństwo uwolnienia presynaptycznego jest wysokie i ułatwienia presynaptyczne, takie jak H-ADF, mogą być niedoceniane. Dlatego mierzyliśmy h-ADF w dojrzałych neuronach CA3 (DIV24–DIV32) zarejestrowanych z fizjologicznym pozakomórkowym wapniem (1,3 mM)22. W tych warunkach stwierdzono, że h-ADF wynosi około +16,4% (Wilcoxon, P<0,01; dodatkowe rys. 2). Wnioskujemy, że h-ADF ulega silnej ekspresji w dojrzałych neuronach zapisanych w fizjologicznym pozakomórkowym wapniu.
h-ADF jest indukowany przez symulowane Ipsp i oscylacje
aby zbadać rolę h-ADF w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, w neuronie presynaptycznym wprowadzono przewodnictwo podobne do GABAA za pomocą dynamicznego zacisku (Fig. 2A, po lewej). Zgodnie z wynikami przedstawionymi na Rys. 1, ApS poprzedzone wstrzyknięciem prądu podobnego do IPSC wywołało większą odpowiedź w neuronie postsynaptycznym w porównaniu z APs wyzwalanym z potencjału błony spoczynkowej (Wilcoxon p<0,001, N=11). Zgodnie z presynaptycznym zwiększeniem uwalniania glutaminianu, PPR zmniejszono, gdy symulowane Ipsps GABAergiczne poprzedzały APs (ze 121% w grupie kontrolnej do 96%; Wilcoxon p<0,05, N=7; DANE nie przedstawiono). Co ciekawe, wielkość wzmocnienia synaptycznego okazała się zależna od wielkości symulowanego IPSP (R2=0,39, P<0,05), co wskazuje, że h-ADF jest klasyfikowany między potencjałem spoczynkowym błony (-74 mV) a hiperpolaryzacją 10 mV (-84 mV; Fig. 2A, z prawej). W rzeczywistości stwierdzono, że współczynnik facylitacji w tym zakresie wynosi 1,8% na mV hiperpolaryzacji.
(a) presynaptyczne IPSPs Lewa, schematyczna reprezentacja układu służącego do wstrzykiwania dynamicznego prądu naśladującego wejście GABAergiczne do neuronu presynaptycznego. Środkowy, przykłady elektrofizjologicznych nagrań z połączonej pary neuronów CA3 w warunkach kontrolnych (czarne ślady) i gdy symulowane wejście GABAergiczne jest wstrzykiwane do komórki presynaptycznej (niebieskie ślady). Racja, wykres punktowy pokazujący znormalizowany EPSP / C jako funkcję wartości szczytowej symulowanego presynaptycznego IPSP. Zaobserwowano wyraźną korelację liniową (y=-1, 8 x+101, 8, R2 Pearsona = 0, 39, P< 0, 05, N=11). (b)H-ADF indukowane podczas subtreshold θ oscylacji w neuronach CA3. Lewa, przykład reprezentatywny. Presynaptyczne skoki są wyzwalane w różnych fazach podczas subtreshold oscylacji potencjału membrany na 4 Hz. Zauważ, że facylitacja jest obserwowana, gdy skok jest wyzwalany podczas hiperpolaryzowanych faz oscylacji. Racja, dane ilościowe (N = 8). Gwiazdy: znaczące zmiany (Wilcoxon, P< 0.05).
następnie badaliśmy modulację siły synaptycznej podczas presynaptycznej oscylacji potencjału membrany. Oscylacja potencjału membrany presynaptycznej przy 4 Hz była wytwarzana przez wstrzyknięcie prądu sinusoidalnego, a pojedyncze skoki presynaptyczne były wywoływane w różnych fazach oscylacji. Zgodnie z poprzednimi wynikami, H-ADF zaobserwowano, gdy ogniwo wystrzeliło w fazach hiperpolaryzacji oscylacji (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon p<0,05, N=8; Fig. 2b). W innych fazach Siła synaptyczna pozostaje niezmieniona (56 ms: 112,2±6%, 163 ms: 95,8±5%, 211 ms: 110,5±6%, Wilcoxon p>0,1, N=8). W szczególności nie obserwuje się d-ADF podczas depolaryzacji, ponieważ jego czas trwania jest zbyt krótki, aby inaktywować kanały Kv1.113. Wnioskujemy, że oscylacje w zakresie θ indukują h-ADF w neuronach CA3.
h-ADF wiąże się ze wzrostem amplitudy skoków aksonalnych
następnie zbadaliśmy mechanizmy leżące u podstaw H-ADF. Możliwym mechanizmem dla h-ADF jest modulacja presynaptycznej amplitudy kolców wywołanej przez hiperpolaryzację. Zbadaliśmy zatem konsekwencje hiperpolaryzacji na amplitudzie skoków mierzonej w aksonie. Neurony CA3 wypełniono Alexa 488 (50 µM) w celu zobrazowania arboryzacji aksonu, a nagrania dołączone do komórek uzyskano z aksonu w odległości od 60 do 240 µm (Fig. 3A). W hiperpolaryzacji somatycznej zwiększono amplitudę skoków aksonalnych (106±1% amplitudy kontrolnej, N=6, Wilcoxon, p<0,05; Fig. 3b). Stwierdzono jednak, że wielkość aksonalnych kolców zmniejsza się wraz z odległością aksonalną o stałej przestrzeni 212 µm (Fig. 3b). Podsumowując, h-ADF w neuronach CA3 wiąże się z miejscowym wzrostem amplitudy skoków w aksonie.
(a) lewy, konfokalny obraz neuronu CA3 wypełnionego Alexą 488. Zabezpieczenie aksonu (biała strzałka) jest identyfikowane po lewej stronie i rejestrowane w konfiguracji dołączonej do komórki. Po prawej, jednoczesne nagrania z soma (góra) i aksonu (dół), gdy kolec jest wyzwalany z spoczynkowego potencjału membrany (czarny) lub z przejściowego hiperpolaryzującego impulsu wstępnego (niebieski). B) po lewej, porównanie amplitudy kolców mierzonej w aksonie wywołanej z (niebieskim) lub bez (czarnym) hiperpolaryzacją przed impulsem. Zwróć uwagę na wzrost amplitudy w aksonie, gdy skok jest wyzwalany z hiperpolaryzującego impulsu wstępnego. Środkowa, ilościowa analiza indukowanego hiperpolaryzacją wzmocnienia aksonalnej amplitudy kolców w sześciu neuronach. Wykres punktowy zmiany amplitudy skoków aksonalnych w funkcji odległości aksonalnej (dopasowanie wykładnicze, y=11,6 e−x/212, r2 = 0,81).
podczas gdy rejestracja całych komórek z aksonów CA3 jest niezwykle trudna w kulturach organotypowych, można ją uzyskać w neuronach piramidalnych L5 z ostrych wycinków5,6. Dlatego najpierw zmierzyliśmy, czy h-ADF można również zaobserwować w połączeniach pobudzających L5-L5. Pary monosynaptycznie połączonych neuronów piramidalnych L5 zarejestrowano w ostrych plastrach z kory sensori-ruchowej młodych szczurów (P14-P20). Stwierdzono, że krótka hiperpolaryzacja w Somie (200 ms, 10-15 mV) neuronu presynaptycznego zwiększa siłę synaptyczną (109,6±2,3%, N=13, Test Wilcoxona, P<0,05; Fig. 4a).
(a) sparowany zapis synaptycznie połączonych neuronów piramidalnych L5. Środkowe, synaptyczne ułatwienie wytwarzane przez krótką hiperpolaryzację presynaptyczną (-20 mV; 200 ms). Epscs odpowiadają średnio ponad 25 śladów. Tak, H-ADF otrzymuje się w 12 parach L5–L5. B) podwójne nagrania soma-Akson w neuronach piramidalnych L5. Po lewej, eksperymentalny projekt pokazujący podwójny zapis z soma i aksonalnego bleb neuronu piramidalnego L5. Środkowy, SOMA-Akson zapisujący w neuronach piramidalnych L5. Zauważ, że krótka hiperpolaryzacja Somy zwiększa amplitudę kolca w aksonie, ale nie w Somie. W prawej górnej części, w aksonie w funkcji potencjału błonowego w ciele komórkowym, dla potencjałów spoczynkowych (czarnych) lub hiperpolaryzowanych (niebieskich) (N=6 śladów dla każdego przypadku). Prawy dolny, Wykres fazowy kolców aksonalnych wywołany w spoczynku (czarny) i po krótkiej hiperpolaryzacji (niebieski). Zwróć uwagę na zwiększoną amplitudę po krótkiej hiperpolaryzacji (strzałka). Szybkość depolaryzacji jest również zwiększona, a próg kolców jest lekko hiperpolaryzowany.
aby potwierdzić, że h-ADF w neuronach piramidalnych L5 był związany ze wzrostem amplitudy aksonów, uzyskano jednoczesne nagrania całych komórek z soma i aksonów ciętych (blebs) (50-80 µm z soma) w neuronach piramidowych L5. Przejściowa hiperpolaryzacja soma (około -13 mV) zwiększyła amplitudę przekroczenia kolca w aksonie, ale nie w soma (+5,5±1,5 wobec -0,3±1,1 mV, N=5, Mann–Whitney, p<0,05; Fig. 4B). Prędkość depolaryzacji również została zwiększona (z 251±59 do 289±56 MV ms−1, n=5), a próg kolców został hiperpolaryzowany (od -35,7±5,2 do -38,8±4,3 mV, n=5). Wnioskujemy, że h-ADF w komórkach piramidalnych CA3 i L5 jest związany ze wzrostem amplitudy kolców mierzonej w aksonie.
h-ADF jest związany ze wzmocnionymi aksonalnymi sygnałami wapniowymi
następnie wykorzystaliśmy obrazowanie Ca2+ do określenia konsekwencji indukowanego hiperpolaryzacją zwiększenia amplitudy skoków w aksonie. Neurony piramidalne CA3 wypełniono 50µm Alexa-594; 250 µM Fluo-4 i sygnały wapniowe wywołane kolcami mierzono w przypuszczalnych butonach en passant w odległości od 150 do 250 µm od soma (Fig. 5A). Całka Ca2+ wywołanego kolcem została zwiększona, gdy kolec presynaptyczny został wywołany po przejściowej hiperpolaryzacji ∼20 mV (126±10%, N = 5; Fig. 5b). Wnioskujemy, że podczas h-ADF hiperpolaryzacja presynaptyczna zwiększa zarówno presynaptyczną amplitudę kolca, jak i indukowany kolcem napływ Ca2+, co następnie zwiększa uwalnianie glutaminianu.
(a) krótki hiperpolaryzujący impuls wstępny wzmacnia wywołany kolcem Ca2+ przemijający. Lewy górny, eksperymentalny projekt pokazujący piramidalny neuron CA3 wypełniony Alexa-594 i Fluo-4. Białe pudełko: obszar powiększony po prawej stronie, pokazujący presynaptyczny butonier. Po prawej stronie, ślady napięcia zapisane w komórce neuronu piramidalnego CA3. Prawy dół, przykład sygnałów fluorescencyjnych rejestrowanych w butonie presynaptycznym. Przemijający Ca2+ wywołany kolcem został zwiększony o ∼20% , gdy presynaptyczny kolec został wywołany po przejściowej hiperpolaryzacji. b) dane ilościowe (n = 5).
inaktywacja kanałów Nav w aksonie określa h-ADF
zwiększona Amplituda skoków aksonowych podczas hiperpolaryzacji może być spowodowana odzyskiwaniem kanałów NAV z inaktywacji. Aby potwierdzić rolę inaktywacji kanału sodowego w h-ADF, użyliśmy modelu neuronowego dwóch monosynaptycznie połączonych neuronów CA3. Następnie określiliśmy częstość modyfikacji inaktywacji kanałów sodowych w aksonie na h-ADF. Gdy półaktywacja aksonalnych kanałów sodowych została ustawiona na -80 mV (refs 18, 19), hiperpolaryzacja somatyczna zwiększyła amplitudę spike 'a, ładunek wywołanego spike’ em prądu wapniowego i transmisję synaptyczną (Fig. 6A, lewa). Wynika to z odzyskiwania kanałów Nav z inaktywacji przez hiperpolaryzację (rys. 6b, po lewej). Jednak nie doszło do zmiany, jeśli półaktywacja aksonalnych kanałów sodowych została ustawiona na -70 mV (Fig. 6A, z prawej). W tym ostatnim przypadku udział dostępnych kanałów Nav jest już bardzo wysoki w spoczynkowym potencjale membrany, tworząc AP o pełnej amplitudzie (rys. 6a,B, prawo). W związku z tym odzyskiwanie po inaktywacji nie wpływa dalej na presynaptyczną amplitudę skoków. Tak więc, h-ADF w modelu jest spowodowany odzyskiwaniem kanałów Nav z inaktywacji i jest zwiększany przez hiperpolaryzację półinaktywacji Nav (rys. 6c).
(a) symulowany H-ADF w warunkach kontrolnych (inaktywacja V1 / 2=-80 mV dla aksonalnych kanałów sodowych). Zwróć uwagę na zwiększoną amplitudę kolca. Brak h-ADF przy depolaryzacji półaktywacji aksonalnego kanału sodowego (V1 / 2=-70 mV). B) podsumowanie dostępności Navaxonu z inaktywacją V1/2=-80 mV lub -70 mV. Zwróć uwagę na wyraźny wzrost z -80, ale nie -70 mV. C) wielkość symulowanego H-ADF jako funkcja inaktywacji V1/2 kanałów Nav w aksonie. Zauważ wzrost h-ADF wywołany hiperpolaryzacją V1/2. D) eksperymentalne wzmocnienie inaktywacji Nav za pomocą CBZ zwiększa wielkość h-ADF. W Warunkach kontroli (po lewej) połączenie to nie wyraża h-ADF. Po dodaniu CBZ, H-ADF jest teraz widoczny (po prawej). e) dane ilościowe dla 10 dojrzałych połączeń CA3–CA3 (dział 24-32). Gwiazda: Wilcoxon, P<0.05.
ponadto wykorzystaliśmy nasz model neuronów do symulacji dostępności aksonalnego kanału nawigacyjnego podczas oscylacji theta podobnej do tej zastosowanej na Rys. 2b. Stwierdzono, że kanały Nav dezaktywują się podczas depolaryzacji i regenerują się podczas hiperpolaryzacji, wyjaśniając modulację EPSC podczas oscylacji (dodatkowe rys. 4). Jednak inaktywacja jest szybsza niż odzyskiwanie podczas oscylacji ze względu na wolniejszą kinetykę Nav przy depolaryzowanych potencjałach (dodatkowe rys. 4). To wyjaśnia, dlaczego Epsc produkowane w 163 ms nie prezentowały żadnego h-ADF, chociaż skok jest emitowany z lekko hiperpolaryzowanego potencjału (Fig. 2b). W rzeczywistości, w tym momencie oscylacji kanały Nav nie miały wystarczająco dużo czasu, aby odzyskać po inaktywacji (dodatkowe rys. 4).
W sumie te wyniki potwierdzają fakt, że h-ADF jest spowodowany odzyskiwaniem kanałów Nav z inaktywacji.
gęstość kanału Nav określa siłę h-ADF
h-ADF zależy od dostępności kanałów sodowych w aksonie. Tak więc zmniejszenie gęstości kanałów Nav powinno wpływać na H-ADF. W rzeczywistości nasz model wykazał, że zmniejszenie gęstości kanału Nav do 70% stanu sterowania zwiększyło h-ADF z 130 do 180% (rys. 7a). Krytycznym parametrem było wzmocnienie presynaptycznego przekroczenia kolca, które zależy od aktywowanej przewodności Na (Rys. 7b). W Warunkach kontroli wartość ta była już wysoka, a hiperpolaryzacja elementu presynaptycznego z -78 do -93 mV zwiększyła amplitudę Skoku o 28%. Gdy gęstość Nav została zmniejszona, ta sama hiperpolaryzacja zwiększyła amplitudę presynaptycznego AP o 42%.
(a) zmniejszenie gęstości kanału Nav w modelu H-ADF. W Warunkach kontroli (po lewej) h-ADF wynosi +30%. Po zmniejszeniu gęstości kanału Nav (70% kontroli, po prawej), H-ADF zwiększa się do +80%. B) Modulacja presynaptycznej amplitudy kolców jako funkcja aktywowanej przewodności Na. W Warunkach kontroli hiperpolaryzacja od -78 do -93 mV tylko nieznacznie zwiększa amplitudę kolców (czarna podwójna strzałka). Gdy gęstość kanału Nav jest zmniejszona, wzrost amplitudy kolców zwiększa się o 20% (jasnoniebieska podwójna strzałka). C) eksperymentalna redukcja gęstości Nav za pomocą TTX. W Warunkach kontroli (po lewej) połączenie to nie wyraża h-ADF. Po dodaniu niskiego stężenia TTX, transmisja jest zachowana, a h-ADF jest teraz widoczny (po prawej). d) dane ilościowe dla sześciu dojrzałych połączeń CA3–CA3 (dział 20-32). Gwiazda: Wilcoxon, P<0.05.
następnie udowodniliśmy eksperymentalnie, że zmniejszenie gęstości kanału Nav zwiększyło h-ADF w neuronach CA3. Dlatego częściowo zablokowaliśmy kanały Nav przy niskim stężeniu tetrodotoksyny (TTX) zastosowanej w kąpieli (15-25 nM). Przy tym stężeniu TTX blokuje ∼80% prądu Na+, ale zachowuje indukcję szybkich kolców Na+ 24,25. W obecności TTX Amplituda skoków w soma została zmniejszona o 45±4% (n = 9), a transmisja synaptyczna przy połączeniach CA3–CA3 została zmniejszona o 55±8% (N=9; dodatkowe Fig. 5). Co najważniejsze, stwierdzono, że zmniejszenie udziału aktywowanych kanałów Nav z TTX 15-25 nM znacznie zwiększa h-ADF w dojrzałych neuronach bez ekspresji h-ADF (z 103±3% w kontroli do 121±4% w obecności TTX, N=6, Wilcoxon p<0,05; Fig. 7c,d). Dane te potwierdzają zatem, że h-ADF w neuronach CA3 zależy od dostępności kanałów Nav.
kanały typu T Ca2+ są obecne w aksonie. Mogą być aktywowane podczas sekwencji hiperpolaryzacji–depolaryzacji stosowanej do indukcji h-ADF, a zatem mogą odpowiadać za H-ADF. Stwierdzono jednak, że h-ADF pozostaje stabilny w obecności 100 nM mibefradilu, blokera kanałów typu T (od 112,2±1,1% w grupie kontrolnej do 116,2±11,9% w przypadku mibefradilu, n=3; Dane nie zostały przedstawione), co sugeruje, że kanały Ca2+ typu T nie uczestniczą w h-ADF.
H-ADF Promuje synchronizację sieciową
następnie przetestowaliśmy implikację H-ADF w synchronizacji sieciowej za pomocą modelu sieci hipokampa utworzonego przez 80 piramidalnych komórek pobudzających (komórki E) i 20 interneuronopodobnych komórek hamujących (komórki i) połączonych ze sobą (Fig. 8a; patrz metody). komórki e I i były zasilane przez wejście stochastyczne. Sieć e-komórek została zsynchronizowana, a oscylacje w zakresie gamma pojawiły się wraz ze wzrostem siły synaptycznej między E-komórkami(dodatkowe rys. 6). Oscylacje te były napędzane przez komórki i: aktywacja komórek e okazała się promować aktywację komórek i, co z kolei wyciszyło całą sieć (dodatkowe rys. 6). Ponieważ h-ADF zwiększa siłę synaptyczną międzypiramidów, gdy skok presynaptyczny jest poprzedzony IPSP, h-ADF jest dobrym kandydatem do promowania tych oscylacji napędzanych komórkami I.
(a) schemat modelu sieci CA3. Sieć składa się z 80 e-komórek (białe trójkąty) i 20 i-komórek (czerwone kółka). Komórki piramidalne i interneurony były karmione przez wejście stochastyczne. Połączenia między neuronami piramidalnymi (niebieskie strzałki) są jedynymi połączeniami, w których można dodać h-ADF, ponieważ h-ADF nie był testowany eksperymentalnie w innych połączeniach. B) zasada H-ADF w synapsach pobudzających między neuronami piramidalnymi. Stosuje się maksymalnie 20% ułatwienie, zgodnie z napięciem membrany mierzonym 17 ms przed skokiem. C) wpływ reguły H-ADF na synchronizację sieci. Lewy górny, rastergram pokazujący aktywność sieci w warunkach kontrolnych z siłą synaptyczną 2,8 mS. lewy dolny, reprezentatywny ślad w komórce E. W prawym górnym rogu, z regułą H-ADF (+20% h-ADF), zwiększa się synchronizacja. Prawy dół, reprezentatywny ślad w e-komórce. Zauważ, że potencjał membrany przekracza granicę-73-mV między kolcami (przerywanymi liniami). (d) widmo mocy danych pokazanych w c (Siła synaptyczna 2,8 mS). Dodanie reguł h-ADF znacznie zwiększa synchronizację sieci wokół częstotliwości gamma (29 Hz). e) współczynniki synchronizacji obliczone dla mocy synaptycznych od 2 do 3,6. Włączenie h-ADF zwiększa synchronizację (niebieski).
reguła H-ADF została włączona do sieci poprzez zwiększenie siły synaptycznej między e-komórkami zgodnie z potencjałem membrany mierzonym 17 ms przed skokiem. W rzeczywistości siła synaptyczna wzrosła o 20%, jeśli potencjał presynaptyczny był poniżej -84 mV (Fig. 8b). Zasada ta pochodzi bezpośrednio z wartości zmierzonych doświadczalnie(patrz Fig. Dla e-komórki-Siła synaptyczna 2.8 mS, dodanie h-ADF w sieci znacznie zwiększyło zarówno częstotliwość odpalania, jak i synchronizację między E-komórkami (rys. 8c-e). W rzeczywistości skłonność do oscylacji w zakresie gamma była znacznie ułatwiona, jeśli H-ADF między E-komórkami był skuteczny (rys. 8e). Co ciekawe, w sieci z hamowaniem manewrowym (ECl=-73 mV zamiast -80 mV w stanie kontrolnym) reguła H-ADF nie poprawiała synchronizacji i nie promowała oscylacji gamma (dodatkowe rys. 6). Jednak ponieważ h-ADF zwiększa siłę synaptyczną między E-komórkami, jego efekt synchronizacji może być po prostu spowodowany wzrostem szybkości skoków sieci. Aby zwiększyć częstotliwość skoków bez wpływu na siłę synaptyczną, zdecydowaliśmy się naprawić siłę między komórkami e na 2,5 mS i zwiększyć częstotliwość napędu zewnętrznego ogniw e z 6 do 20 Hz. Wykreśliliśmy współczynnik synchronizacji w porównaniu z szybkością skoku sieci. Nawet jeśli synchrony okazały się liniowo skorelowane z szybkością skoków, h-ADF zwiększył współczynnik synchronizacji dla dowolnej częstotliwości skoków w zakresie 4-14 Hz (dodatkowe rys. 6). Pokazało to, że w przypadku niskiej częstotliwości skoków, h-ADF zwiększa synchronizację niezależnie od średniej aktywności sieci. Podsumowując, w naszym modelu h-ADF zwiększa synchronizację sieci i promuje oscylacje, łącząc siłę synaptyczną międzypiramidów z aktywnością interneuronów.