1 이론
올리고뉴클레 합성의 첨가에 의해 하나의 기본에서 시간을에서 확장,3’to5′-end,첨부하여 고체상을 지원합니다. 올리고 뉴클레오타이드의 화학적 합성이 완료되면,DNA 사슬은 수산화 암모늄과의 배양에 의해 고체 지지체로부터 방출된다. 암모늄은 또한 포스 포 디에 스터 결합에서 인산염을 보호하는 그룹을 쪼개어 탈 보호제 역할을합니다. 이 후,뜨거운 암모니아는 추가 hydrolyze 보호 그룹에서 exocyclic 아미노 그룹의 deoxyadenosine,deoxycytosine 및 deoxyguanosine. 상기 올리고뉴클레오티드는 조제물로서 암모니아 용액에서 사용자에게 공급될 수 있었다. 이 경우에는,사용하기 전에,그것은 수를 수행하는 데 필요한 추가적인 단계를 제거하는 염 및 에 의하여 제품에서 올리고뉴클레오타이드 준비 중에 생성되는 deprotection.
탈보호 후,올리고뉴클레오티드 제제는 통상적으로 탈염,정량화,동결 건조기에서 건조되도록 증발시키고,분말 형태로 사용자에게 공급된다. 탈염된 올리고뉴클레오티드 용액은 전장 올리고뉴클레오티드를 함유하지만 또한 화학 합성 동안 축적된 잘린 생성물의 혼합물을 함유한다. 잘림은 지정된베이스가 해당 사이클에서 체인에 추가하지 못할 때 발생합니다(Hecker&Rill,1998). 따라서,백분율의 잘리 제품에서 축적한 준비에 의해 결정된 합성효율(다수의 전체 길이는 제품 합성 후)길이의 분자입니다. 합성되기 위해 더 많은 사이클을 필요로하는 긴 올리고뉴클레오티드는 짧은 올리고뉴클레오티드보다 덜 순수하다. 이러한 오류도와 경쟁 전체 길이의 제품에 어떤 응용 프로그램이 필요할 수 있습 제거하기 전에 oligonucleotide 사용할 수 있습니다. 그러나,desalted oligonucleotide 준비하는 일반적으로 많은 응용 프로그램에 적합한 표준으로 PCR 또는 microarrays,는 경우에 특히 올리고뉴클레오타이드는<20 뉴클레오티드에 길이 있습니다.
더 정화를 위해 올리고뉴클레오 이상 50 기지하는 것이 좋은 비율의 전체 길이의 제품을 준비에는 일반적으로가 더 높은 80%. 까다로운 애플리케이션을 위한 정확한 길이의 올리고뉴클레오타이드와 같은 중요한 젤 이동 분석,mutagenesis 사이트 시퀀싱,생산의 복제 어댑터 또는 첫 번째 스트랜드 cDNA 를 합성에 대한 세대의 라이브러리,추가적인 정화에는 권장도에 대한 짧은 oligonucleotides(에 대한 자세한 정보를 참조하십시오 기술은 위의 표준에 vitro 분석 실험을 위한 단백질 핵산의 상호 작용-Gel shift 분석 실험을 위한 RNA and DNA 바인딩 및 Mutagenesis 사이트).
합성 후 또는 올리고 뉴클레오타이드의 효소 적 변형 후에 정제가 필요할 수있다. 이를 달성하기위한 몇 가지 방법이 있으며,선택은 올리고 뉴클레오타이드의 성질과 그것이 의도 된 적용에 달려있다.
역상 HPLC 정제는 소수성에 기초한다. 사용 nonpolar 고정 단계,및 수용성 buffers 및 유기 용제로 모바일 단계 용 analytes;극한 화합물은 용출된 첫째,nonpolar 화합물은 유지됩니다. 이는 최상의 방법을 정화하는 올리고뉴클레오으로 수정 소수성 그룹과 같은 비오틴,형광성 염료 레이블,또는 경기도-에스테르의 활용형이 있습니다. 대량 복구보다 높을 때 사용하여 페이지의 정제 및 그것은 순종의 정화를 위해 더 많은 양의 oligonucleotides(mmole 규모),지만 제거하지 않고 불완전한 제품을 효과적으로. 역상 크로마토 그래피에 기초한 올리고 뉴클레오티드 정제 카트리지는 올리고 뉴클레오티드를 탈염 및 정제하는 빠른 방법을 제공한다.
폴리아크릴아미드 겔 전기 이동법(페이지)해결합 oligonucleotides 에 따라 자신의 길이와 함으로써 은 충분한 해결책을 구별하는 전체 길이는 제품에서 실패하는 분자(앳킨슨 스미스,1984). 폴리아크릴아미드 겔 더 효과적인지를 분리하기 위한 작은 조각을보다 DNA agarose 젤(참조 분석 RNA 의 의 분석적인 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 Agarose Gel Electrophoresis). 폴리 아크릴 아미드 젤의 유일한 단점은 아가 로스 젤보다 준비하고 취급하기가 더 어렵다는 것입니다. 폴리 아크릴 아미드 겔은 일정한 전기장에서 수직 구성으로 실행됩니다. 후에는 전기,올리고뉴클레오타이드가에서 eluted 젤과 집중을 사용하여,에탄올을 강수량(에 대한 자세한 내용을 확인 강의 핵산에서 RNA 정화 강수량 방법)또는 역 상 크로마토그래피. 이것은 전장 올리고뉴클레오티드의 가장 높은 비율이 까다로운 적용을 위해 요구될 때 선택의 방법이다. 또한 30 염기보다 긴 올리고 뉴클레오티드에 강력히 권장됩니다. 또한 여러 샘플을 동시에 실행할 수 있으며 값 비싼 장비가 필요하지 않습니다. 이 기술의 유일한 단점은 정제 당 얻어진 소량의 올리고 뉴클레오타이드이다. 일반적으로는 올리고뉴클레에서 사용되는 스케일의 1µ 미만의 질량은 후 복구하는 페이지를 정화<50%더 낮은 경우의 수정 oligonucleotides. 그럼에도 불구하고 수율이 낮지 만 대부분의 생화학 적 적용에 만족 스럽습니다.
올리고 뉴클레오티드 제제는 레인 당 적어도 1mg 의 양으로 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에 적재된다. 겔의 분해능 범위는 폴리 아크릴 아미드의 농도에 따라 달라집니다. 에 대한 짧은 oligonucleotides(15 35 기초),13-15%폴리아크릴아미드 겔는 권장하며 더 이상 올리고뉴클레오티드(35~70 기초),8-13%폴리아크릴아미드 겔을 권장합니다. 젤의 비율은 실행중인 시스템에 적응해야합니다. 우리는 일반적으로 Bio-Rad Mini Protean II 시스템을 사용하고 15%겔을 실행하여 길이 25 염기의 올리고 뉴클레오타이드를 정제합니다. UV 시각화에 의한 올바른 밴드의 식별 후,밴드가 여기되고 겔로부터 추출된다.
폴리 아크릴 아미드 겔로부터 올리고 뉴클레오티드를 정제하는 두 가지 상이한 방법이이 장에서 설명된다. 가장 간단한 방법은 확산 방법에 의한 용출입니다. 이것은 더 높은 농도의 영역에서 더 낮은 농도 중 하나로의 분자의 움직임을 기반으로합니다. 확산의 결과는 재료의 점진적인 혼합입니다. 이 방법은 시간이 많이 걸리지 만 너무 많은 노동력이나 장비가 필요하지 않습니다. 기본적으로,관심있는 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 밴드는 작은 조각으로 슬라이스되고 용출 완충액으로 덮여있다. 배양 후,dna 는 에탄올 침전에 의해 상청액으로부터 정제된다. 수율은 올리고 뉴클레오타이드의 길이에 따라 20%에서 70%사이로 제한된다. 사용되는 용출 완충액의 양이 많을수록 겔로부터 더 많은 올리고 뉴클레오타이드가 확산된다.
두 번째 방법은 투석 백으로의 감전(McDonell et al., 1977). 올리고 뉴클레오티드를 함유하는 겔 조각을 절제하고 완충액을 갖는 투석 백에 넣는다. 전류의 적용은 DNA 가 겔에서 투석 백 완충액으로 빠져 나가게합니다. 올리고뉴클레오티드는 이 완충액으로부터 회수되어 정제된다. 이 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 분리될 수 있으로 좋은 수익률,그것이 비록 시간이 걸리는 경우 많은 수의 샘플을 정제하는 동시에,필요로하기 때문에 삽입의 각 젤 밴드로 개별적인 투석백입니다. 이 방법은 더 큰 DNA 단편에도 잘 작동하며 아가 로스 겔에서 DNA 를 추출하는 데에도 사용할 수 있습니다.