평가 IC50 수준은 후 즉시 처리와 항암제 시약을 사용하여 실시간으로 세포 모니터링 장치

소개

실시간으로 세포-모니터링 분석(RTCA)systemwas 이전에 개발의 지속적인 모니터링을 위한 부착 cellcultures(1). 이 라벨이 없으며비 침습적 인 방법은 조직 배양 판의 기저부에있는 interdigitated 영역 사이의 electricalimpedance(cell index,CI)의 측정을 기반으로합니다. CI 측정은 adherentcells 의 생물학적 상태에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 실제로 CI 의 의미는 생존 세포의 수입니다.E-플레이트의 표면. 이러한 데이터에는 실시간 프로파일로서의 세포 수,생존력 및 형태가 포함됩니다(2-4). RTCAsystem 은 일부 시약(5)에 대한 adynamic 표현형으로서 세포 반응의 조기 발견 장치로 알려져있다.

에서 우리의 이전 연구 imatinib 세포 독성에 oralsquamous 세포 암(OSCC)평가를 사용하는 WST-8(5– 3-(2- methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2-tetrazole-3ium)분석 결과로 anendpoint 측정(6)및 thenlater 로 RTCA 시스템(7)입니다.MTT(3–2,5-diphenyltetrazolium bromide)및 WST-8 분석법에 의한 종점 측정은 세포 독성을 평가하는 데 일반적으로 사용됩니다. 그러나,그러한 분석은다른 항암제 다른 세포주의 효과의 변형에 의해 제한된다. 또한,시험 관내 종말점 분석법에 의해 계산 된 IC50 값은 생체 내 유효 농도가 높은 경향이있다(8,9).

에서 우리의 이전 연구 IC50valuesmeasured 에 의해 RTCA 시스템보다 낮았다 사람들에 의해 측정 theWST-8 분석을 제안하고,RTCA 시스템을 수 있습 sensitivelyevaluate 세포 독성 및 영향의 imatinib 에 celladhesion. 그러나,그것은 분명 여부를 평가 theIC50 의 값을 다른 항암제를 사용하 RTCAsystem 유용할 것이기 때문에 차이가 있 cytotoxicreactions 사이에 대상으로 분자와 같은 약 imatinib andanticancer 에이전트를 통한 시간입니다.

이 연구에서는 우리를 선택해야 몇 가지 유형 ofcell 줄이기 위해서는 차이를 확인하기 위해 세포의 reactionprofile 에 대한 항암 시약을 사용하여 실시간으로 RTCA 시스템입니다.Non-invasive SQUU-세포 및 침 SQUU-B 세포 라인 whichwere 설립된 지역에서 재발하는 혀의 암종양에서 단 환자,선정되었기 때문에 우리에 종사하는 researchon 의 전이 SQUU-B 세포 라인을 사용하여 SQUU-세포 라인과 SQUU-Bcell 라인(10-12). SAS 세포주는에서 확립되었다.혀의 분화 된 인간 편평 세포 암종(13). NA 세포주는 피브로넥틴 생성 세포주(14)로 확립되었다. 또한,보고되고 있는 세포 독성의 항암 시약 OSCC 되었습 evaluatedin SQUU-세포 라인과 SQUU-B 세포 라인(15),SAS 세포 라인(16),NA 세포 라인(17)을 이용하여 다양한 기존의 방법이 있습니다.그 이유는,우리가 선택한 네 이러한 세포 라인과 함께 eachcharacteristic 기능은 현재의 연구에서는 또한 사용 cytotoxic 분석 결과에 이전 연구이다.

이 연구에서는 우리에 초점을 맞춘 새로운 RTCA devicedeveloped 에 대한 실시간 측정하고 평가 theIC50 값으로 확장을 평가하는 세포 독성 offour 항암 에이전트로에서의 네 OSCC 세포 라인. Thisallowed 우리에 대한 정보를 얻을 변 observedbetween 다른 항암 시약과 세포 라인 inreal 니다.

의 목표 본 연구 obtainIC50 프로파일에서 즉시 또한 후 ofanticancer 에이전트를 사용하여 RTCA 시스템입니다. 이 연구는 종점 분석법과 비교하여 rtca 시스템을 사용하는 항암제의 세포 독성을 평가하는 이점을 입증했습니다.

재료 및 방법

시약 및 재료

5-플루오로 우라실(5-FU)을 100mM indimethylsulfoxide(DMSO;Sigma-Aldrich Inc.,세인트 루이스,MO,미국).Doxifluridine 과 carboplatin 을 증류수에서 각각 100 물 및 50mM 로 희석시켰다. 도세탁셀을 10mM 이네탄올로 희석시켰다. 모든 항암 시약은 Wako PureChemical Industries,Ltd 에서 공급되었습니다.,(오사카,일본)및 -20℃에서 저장.

세포 배양

인간 oscc 세포주 SQUU-a,SQUU-B,SAS 및 nawere 는 인간 혀 샘플로부터 유래 하였다. Morifuji-Wilson M(일본 구마모토 구마모토 대학교)이 제공 한 SQUU-A 와 SQUU-B 는 국소 재발 성 tonguecancer 종양(18)으로부터 확립되었다. SAS(13,19,20)는 Riken BRC 셀 뱅크(일본 츠쿠바)에서 구입했습니다. NA(14)는 Jun-ichi Iwata 박사(큐슈 대학;후쿠오카,일본)가 친절하게 제공했습니다. Dulbecco 의 수정 된 독수리 배지(DMEM;Nacalai Tesque,Inc.)에서 유지 된 모든 세포 계통,교토,일본)가습 된 대기 중 37°C 에서 10%의 태아 송아지 혈청(Biowest,Nuaille,France)을 함유 5%CO2.

RTCA 세포독성 분석법에 의해 OSCC 세포 증식의 측정

ci 는 iCELLigence system(ACEABiosciences,Inc.)에 의해 획득되었다.,샌디에고,캘리포니아,미국)RTCA 시스템으로. Allmonitoring 은 조절 된 CO2content(5%)로 37°c 에서 수행되었다. E-판(문화 번호판에 대한 iCELLigence 시스템)을 포함한 200µl 문화 중간당했 equilibrated to37°C CI 설정한 제로에서 이러한 조건이 있습니다. 세포(달리 명시되지 않는 한 2×104 세포/웰)를 첨가하여 560μl 배양 배지 항암제를 24 시간 후 세포를 첨가 하였다. Ci 는 96h 애프터 셀 시딩에 대해 실시간으로 모니터링되었습니다. IC50 값은 RTCAData 분석 소프트웨어 버전 1.0(ACEA Biosciences,Inc.)에 의해 계산되었습니다.).

이전 연구(21-25)에서 Cmax 값을 기준으로 4 가지 항암제의 8 점 농도가 설정되었습니다. 또한,24 시간 및 48 시간을 포함하여 72 시간 동안 시간 포인트를 설정하였으며,이는 종점 분석법에서 세포 독성을 평가하는 일반적인 방법이었다.

Curve fitting 의 IC50data

우리는 우리 사용되는 다음과 같은 자형 복용량 responseformula 을 계산하 IC50values:Y=낮은 CI+(HighCI-낮은 CI)/{1+10^(로그 IC50-X)},는’저 CI’represents 최소 CI 값이’높은 CI 는 maximumcell 인덱스 값,Y 셀 지수 및 X 로그 ofconcentration(M).

OSCC 세포 증식의 측정 WST-8 분석

oscc 세포의 초기 시딩 및 배양 후,배양 배지를 제거하고 항암제 함유 배지로 대체 하였다. 24,48,72h 의 배양 후,20μl WST-8 염료(셀 카운팅 키트-8;일본 도쿄 도진도 주식회사)를 각각의 웰에 첨가 하였다. 3 시간 후,플레이트를 450nm/655nm 에서 판독 하였다. 세포 생존율은 아래(7)를 사용하여 계산되었다. IC50values 는 thepercentage 생존 대 약물 농도의 선형 근사 회귀에 의해 계산되었다.

세포 생존율(%)=(a-c)/(b-c)×100(a=서 흡광도를 각각의 농도의 항암 시약,b=흡광도에 0µM 의 항암 시약,c=흡광도의 빈).

통계 분석

모든 데이터는 세 가지 독립적 인 실험의 평균±표준 편차(SD)로 표시됩니다. Rtca 시스템과 WST-8assay 를 사용하여 얻은 nic50 값 사이의 상관 관계는 Spearmantest 에 의해 통계적 유의성에 대해 평가되었습니다. P<0.05 의 두 꼬리 값은 할당 된 것으로 간주되었다.

결과

의 효과 항암 agentconcentration 에 OSCC 세포 증식을 사용하여 RTCA 시스템

우리는 평가의 세포 독성 네 anticancerreagents(5-FU,독시 플 루리 딘은,carboplatin,그리고 docetaxel)에 fourOSCC 세포 라인에 의해 모니터링 CI 값을 96h 후 셀었 시드에서 2×104 세포/에 잘 E-판(Figs. 1–4). Ci 값은 4 개의 oscc 세포주 모두에서 adose 의존적 방식으로 감소되었다. 따라서 ci 값의 thereduction 은 세포의 감소와 상관 관계가 있습니다 number.As 도에 도시. 2,ci 값 forinvasive SQUU-B 세포주는 다른 OSCC 보다 낮았다 cells.As 도에 도시. 도 3 에서,Sas 세포주에 대한 CI 프로파일은 48 시간 후에 지연된 증가를 보였다. 도 4 에 도시 된 바와 같이,na 세포주에서의 증식 속도 및 최대 CI 값은 oneof 다른 세포주보다 높았다.

실시간 측정 theIC50 프로파일 항암제의 에이전트로서 OSCC 사용하여 세포 RTCA 시스템

IC50 프로파일의 네 anticancerreagents 네 OSCC 세포 라인에 의해 결정됩 RTCAsystem 및 계산에 의하여 상업적인 소프트웨어와 함께 제공됩 theinstrument(의 하위 집합 SQUU-B 데이터는 그림에 표시됩니다. 5). IC50 값은 항암제를 첨가 한 후 72 시간 동안 표시되었습니다. 4 개의 셀 라인 모두에 대해 24,48 및 72h 에서의 TheIC50 값은 표 I-IV 에 요약되어있다. 5,5-FU 의 세포 독성 반응에 시간 지연이 있었다(도 5). 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. 반면,wst-8 분석법을 사용한 squu-B 의 세포 생존력 곡선은 보충 자료(도 1)에서도 나타났다. S5-S8). R2 에서 값 72h afteraddition 항암 시약 WST-8 분석 결과는 낮에 fouranticancer 시약과 비교 하나의 24 시간,48h. Theseresults 보여주는 것이 바람직하다고 끝점으로 분석을 수행에서는 24 시간 또는 48 시간으로 사용되는 일반적인 프로토콜입니다. 에 thisstudy,세포 생존 곡선의 WST-8 분석 결과였 insupplemental 재료가 없었기 때문에 참신하는 방법에 tocalculation 의 IC50 값을 사용하는 WST-8 분석하지 않아도 됩니다.

사이의 상관 관계 실시 timemeasurements 의 IC50 값을 사용하여 RTCA 시스템 andendpoint 측정 IC50 값을 사용하는 WST-8assay 에 OSCC 세포

으로 그림에 표시됩니다. 두 가지 방법을 사용하여 24,48 및 72h 에서 6,IC50 값을 배치했습니다. 가로축은 rtca 시스템을 사용하여 측정 한 실시간 IC50 값을 보여 주며 세로 축은 WST-8 분석법을 사용하여 측정 한 sendpoint IC50 값을 보여줍니다. 두 가지 유형의 분석 사이에 아포지 상관 관계가 관찰되었습니다.각 항암제에 대한 IC50 을 측정하는 방법.의 결과 5-FU,독시 플 루리 딘은,carboplatin,그리고 docetaxcelwere y=8.19x+346.02(R2=0.94,rs=0.66,*P<0.05),y=1.00x+172.70(R2=0.91,rs=0.82,**P<0.01),y=1.90x+206.81(R2=0.92,rs=0.96, **P<0.01),앤디=13.53x+0.08(R2=0.95,rs=0.73,*P<0.05),각각합니다. Real-timeIC50 값은 해당 엔드 포인트 IC50 값보다 낮은 경향이있었습니다.

토론

RTCA 에 의해 계산 된 CI 값은 셀 상태(3)를 나타냅니다. 무화과에 assshown. 1-5,CI 값의 SD 값은 tosee 가 너무 작았습니다. 예를 들어,도 1 의 모든 SD 값.1 은 0.05 미만이었다. 는 이유에 대한 저 CI 값의 SQUU-B wassuggested 는 접착은 단백질 E-cadherin 이 essentialrole 에는 전이,감소된 수준의 E-cadherin promotingcell 마이그레이션 및 휴 침략(26). 는 이유에 대한 고 max CI 값 ofNA 제안했다는 보고되었는 fibronectinaccelerated 세포 증식 및 접착력 때문에 기능 ofNA 세포 라인으로 fibronectin 생산 세포 라인(6). 따라서,각 세포 계통의 세포 반응 4 개의 항암 시약이 가변적이었다. 우리는이 연구에서 IC50 값과 세포주 사이의 인과 관계를 찾을 수 없었다. 그러나,그것은 중요한 todetect 세포의 반응에 실시간으로 CI 프로필을 평가하 thecytotoxicity 항암제의 시약을 고려할 때 pharmaceuticalapplication 하는 인간입니다.

SQUU-b 세포주의 IC50 프로파일은도 1 에 설명되어있다. 5arepresentative IC50 프로필이 있었기 때문에 nodifferences 에 IC50 패턴 프로필에서 동일한 세포 라인을 넣의 동일한 시약,하지만 우리가 계산 IC50valuesin 모든 세포 라인을 사용하여 네 개의 항암 reagents. 우리는 theIC50 프로파일이 각 항암제 및 ineach oscc 세포주에 대해 다양하다는 것을 발견했다. 도에 도시 된 바와 같이.5,5-FU 및 docetaxel 필요한 더 많은 24h(48h thefigure)를 시작하는 발휘 세포 독성에 영향을 OSCC 세포는 반면,IC50values 에서 회복되어에 대해 24h(48h 에서 그림)에 추가한 후 독시 플 루리 딘은 andcarboplatin. 따라서 우리는 real-timeIC50 프로파일의 차이가 항암 시약에 의해 유발되었다고 제안했다. Rtca 를 사용한 실제 측정 없이는 그러한 보존이 불가능했을 것입니다. TheIC50 값을 실시간으로 모니터링하면 이러한 값이 시간이 지남에 따라 크게 변하는 것으로 나타났습니다. 의 가능성이 있는지 detectingchanges 전통적인 방법을 사용하여,하나뿐이기 때문에 시간 지점의 IC50 치료 후,항암제 isevaluated 끝점에서 분석하지 않아도 됩니다.

RTCA 시스템과 전통적인 endpointassays 수 있기 때문에 측정의 임피던스이는 비침범성할 수 있는 높은 품질을 제공,정량 데이터에서 세포 독성에 acontinuous 니다. 도에 도시 된 바와 같이.6 가 있었다 중요한 긍정적 상관관계 betweenIC50 얻은 값을 가진 RTCA 시스템 WST-8assay 도가 있었지만 약간의 차이에서 절대 valuesof CI 와 같은 낮은 CI 얻어진 값에 대한 SQUU-B 세포 라인입니다. Theseresults 는 일부 세포 계통에 대해 얻은 낮은 CI 조차도 RTCAsystem 에서 세포 독성 고감도를 평가할 수 있다고 제안했다. 반면,실시간 IC50 값은 RTCA 시스템으로 얻은 실시간 Ic50 값을 WST-8 분석법으로 얻은 endpoint IC50 값과 비교할 때 endpoint IC50 값보다 낮았다.이러한 결과는 RTCA 시스템이 세포 증식 및 접착에 대한 항암제의 효과를 민감하게 평가할 수 있음을 시사한다.

RTCA 시스템에서 부착 셀은 절연체 역할을합니다.전극의 표면과 전극 용액의 이온 매체를 변경하여 임피던스(27)를 증가시킵니다. 따라서,CI 는 세포의 함수이다.서로 다른 시간 간격으로 세포의 수와 비율. CI=0 일 때세포 접착력(5)이 없다. RTCA 시스템에 의해 기술 된 CIchanges 는 동적 표현형 ofcell 을 반영한다. 이러한 동적으로 모니터링 셀-약품 상호 작용할 수 있습에게 usto 을 잘 이해의 시간 효과는 생체외,특히 직후 치료 의약품(28). Thecells 의 키네틱 기능은 wst-8assay 와 같은 aconventional single end-point assay 에서 획득 할 수없는 통찰력있는 정보를 제공합니다. 반면,WST-8 분석 결과는 survivalcell 의 대사 반응을 반영한다(29). Wst-8assay 를 사용한 독성은 동적 세포 반응이 발생했지만 세포 대사 반응이 있었다면 과소 평가 될 수 있습니다. 우리는 suggestedthat 이러한 차이의 원금에는 두 가지 방법을 유도 했 ahuge 의 차이 IC50 값은 최대 8 시간을 사이에 두 가지 방법 중로 그림에 표시됩니다. 6A.Ourprevious 연구에 따르면 RTCA 시스템과 WST-8 분석법으로 계산 된 SQUU-Acells 에서 imatinib 의 IC50 은 각각 4μm 과 60μm(15 배 민감도)이라고보고했습니다(6,7). Otherresearch 그룹은 RTCA 시스템 및 WST-8 분석법으로 계산 된 HK-2cells 에서 시스플라틴의 IC50 이 각각 0.76μm 및 25μm(33 배 민감도)이라고보고했습니다(30,31).이러한 이전 데이터는 유효성을 보여주기 위해 우리의 데이터를 지원했습니다.

그것은 중요한 측정 값을 얻을 fromimmediately 후 처리와 항암제를 평가하 boththe 의 효과 측면 에이전트와 원하는 효과. 그러나 인비트로 데이터와 인간 생체 내 데이터를 상관시키는 유용한 방법에 대한보고는 거의 없다. 우리는 rtca 시스템을 사용한 실시간 측정이 normalcells 에서 항암제의 부작용에 유리할 것이라고 생각했습니다.

이전에보고 된 5-FU,doxifluridine,carboplatin 및 docetaxel 의 Cmax 값은 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), 인간에서 정맥 내 치료에 사용될 때 각각 2μm(24,25). Ourdata 는 Cmaxvalues 가이 연구에서 사용 된 실험 용량의 범위에 포함 되었기 때문에 인간 데이터와 상관 관계가 있습니다.

RTCA 시스템은 새로운 주 장치 toevaluate 세포 독성,고용 임피던스의 강도 celladhesion 지 효소 활동에서 목표 세포와 같은 MTTassay. 에 의해 계산 된 항암제의 IC50 값 RTCA 시스템은 종래의 종점 분석법에 의해 계산 된 IC50levels 와 유의 한 상관 관계가 있었다. 또한 RTCA 시스템은 항암제로 치료 한 직후에 실시간으로 자동으로 측정 값을 얻었습니다.

실제로,RTCA 시스템을 평가할 directlyconcrete 세포 독성 등으로 세포 사망 또는 apoptosis 그래서 때문에,셀 지수 계산 기반으로 임피던스이다. 그 이유는,조합을 분석 결과 사 RTCA 시스템 셀 deathmeasurement 수 있습 효과적인 방법의 경우에는 평가 ofconcrete 세포의 반응과 같은 세포 사망 또는 apoptosis 을 정확하게 합니다.예를 들어,Annexin V 염색하거나 식 caspase-3assayfor 탐지 apoptosis,Lactate Dehydrogenase(을 알아낼)releaseassay 의 탐지를 위한 세포의 죽음을 수 있습 효과적인 방법(32,33). 또한,그것이 유용할 수 있습니다 toevaluate 식의 염증성 단백질로서 정상세포 fordetection 의 부작용을 할 때 항암 시약에 추가되었 thenormal 세포에서 시드 E-판이다. 동적 실시간 모니터링 duringcell 문화를 포함한 항암제 시약을 제공할 수 있습 valuableinsights 의 조기 발견을 위한 치료 효율성과 sideeffect 할 수 없는,평가에서 기존의 방법에서 최종 pointassay. 그래서,IC50 값에 의해 계산된 RTCA 시스템을 수 있습 유용 매개변수에 대한 검열과 같은 관점에서 ofreal 간 측정 자동화,회의 colorimetricallyproblems 또는 오염. 또한,RTCA 시스템은 실험의 전체 기간 동안 theanalysis 를 허용하고 세포 배양에 부정적인 영향을 줄 수있는 라벨링을 요구하지 않습니다.

본 연구의 참신함은 rtca 시스템이 종래의 방법,WST-8 분석법과 비교하여 세포 독성 고감도를 검출 할 수 있다는 것이다. 또한,RTCA 시스템 evaluateIC50 값을 귀하게 실시간 없이 restrictionof 실험적인 기간에 대한 적어도 72h 후 외 ofanticancer reagents.

에서 결론적으로,우리의 결과를 증명하는 RTCAsystems 유용한 분석실험 세포 독성 및 사용될 수 있습 infuture 개발의 화학요법 에이전트를 사용하여 암 cellsand 의 평가는 그들의 효과 측면에서 정상세포. 또한,RTCA 시스템을 평가하는 데 사용할 수 있습니다 세포의 반응 프로파일과 같은 조합 치료와 항체-세포 또는 약 druginteractions,항암제의 reagents.

보충 자료

데이터를 지원

승인

적용되지 않습니다.

자금 조달

자금 조달을받지 못했습니다.

데이터의 가용성 및 자료

사용되는 데이터 집합 및/또는 동안 분석 presentstudy 에서 사용할 수 있는 해당 저자에 reasonablerequest.

저자의 기여

MH 와 MN 은 연구를 고안하고 설계했다. MH andTN 은 실험을 수행하고 데이터를 획득했습니다. MH 는데이터를 준비하고,수치를 준비하고,원고를 초안했다. MH,TKY 및 mn 은 결과를 해석했습니다. MH 와 TKY 는 주제를 편집하고 수정했습니다.스크립트. 모든 저자는 최종 내용을 읽고 승인했습니다.관리자.

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해당 없음.

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