はじめに
サラセミアは、ヘモグロビンのグロビン鎖の合成が減少または不在によって引き起こされ、グロビン鎖の不均衡につながる東南アジアで最も一般的な遺伝性血液疾患である。 α-サラセミアは主要なサラセミア型の一つであり、16番染色体上のα1-グロビン遺伝子（HBA1）またはα2-グロビン遺伝子（hba2）の変異によって引き起こされる。1遺伝子変異は、α-グロビン鎖の減少または不在に応じて臨床的変数をもたらす。 タイでは、α-グロビン遺伝子変異の最も一般的なタイプは、特に東南アジア（SEA）型欠失（–SEA）と命名された二つのα-グロビン遺伝子（α-サラセミア1）の欠失であり、続いて一つのα-グロビン（α-サラセミア2）の欠失であり、それぞれ3.7kbまたは右向き欠失（-α3.7）および4.2kbまたは左向き欠失（-α4.2）である。 タイで最も一般的な非欠失α-グロビン遺伝子変異はヘモグロビン定数スプリング（Hb CS、aaCS）である。 東南アジアで最も一般的なHBB遺伝子変異の一つであるヘモグロビンE（Hb E）は、様々な臨床症状に関連するヘモグロビン症またはサラセミ表現型のいず
α-サラセミアの臨床的および血液学的症状は、サイレントキャリアから致命的なHb Bartの胎児水腫症候群に至るまで可変である。 Α-サラセミア1とα-サラセミア2の相互作用はヘモグロビンH(Hb H)疾患を引き起こし、hb h疾患とヘテロ接合性Hb Eとの相互作用はAE Bart病をもたらす。2,3Hb Hは、欠失および非欠失Hb h疾患を含む二つの主要な形態に特徴付けられる。 欠失Hb h病は、一方の16番染色体上のα-グロビン遺伝子の両方を除去する欠失と、他方の16番染色体上の単一のα-グロビン遺伝子のみを除去する欠失 非欠失Hb h疾患は、一方の染色体16上のα-グロビン遺伝子の両方を除去する欠失と、他方の染色体16上のHBA1またはHBA2遺伝子のいずれかを含む点突然変異または小さな挿入/欠失の組み合わせに起因する。 異なる集団における臨床表現型，血液学的パラメータ，α-グロビン遺伝子型，および実験室バイオマーカーとの相関を研究した。4-6
本研究の目的は、α-サラセミアのHb H病およびAE Bart病型の両方における血液学的パラメータ、ヘモグロビンタイピング、提示時の年齢、輸血要件、年齢およ タイ中部のサラセミア患者の三次ケアセンターであるＰｈｒａｍｏｎｇｋｕｔｋｌａｏ病院で治療したｈ ｂ ｈ病およびＡ Ｅ Ｂａｒｔ病の小児における実験室バイオマーカーおよび遺伝子プロファイルを含む各変異の遺伝子型–表現型相関を示した。
患者と方法
患者の選択
タイのバンコク、Phramongkutklao病院の小児科、血液診療所で治療された七十から六α-サラセミア患者は、この研究に登録されました。 書面によるインフォームドコンセントおよび同意書は、研究に登録する前に、すべての参加者および子供の両親または保護者から取得されました。 研究プロトコルは、1975年のヘルシンキ宣言とその改訂の倫理原則に従って、タイのバンコク、Phramongkutklao病院と医科大学の制度審査委員会によって承認されました。 包含基準には、hb H病およびAE Bart病と診断された患者が18歳以上であり、書面によるインフォームドコンセントおよび私たちの研究に参加することに同意した患者が含まれる。 血液学的データ，ヘモグロビンタイピング，医療記録からのα-グロビン遺伝子変異解析などの不完全なデータを有する患者は研究から除外された。
Hb H病患者58人とAE Bart病患者18人の合計が含まれていた。 患者の大半はタイの中央部から来た。 Α-サラセミア患者は臨床的に輸血依存性と非輸血依存性に分類された。 患者はまた、成長パラメータについて検討した。 Α-サラセミア患者は，初回輸血時の年齢，輸血要件，身体検査，血液学的データ，検査バイオマーカー，ヘモグロビンタイピング，α-グロビン遺伝子変異解析などの検査に基づいて診断された。 完全な臨床病歴を成長パラメータと共に記録した。 血液学的データ、実験室バイオマーカー、およびヘモグロビンタイピングは、医療記録から遡及的に得られた。血液学的および生化学的パラメータ＜／ｐ＞＜ｐ＞血液学的分析は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｈ Ｍ Ｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｈ Ｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して行った。 ヘモグロビンプロファイルおよび胎児ヘモグロビン（Ｈ Ｂ Ｆ）濃度は、毛細管電気泳動（ＣＥ；Ｍｉｎｉｃａｐ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｅｂｉａ，Ｐａｒｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅ Ｌｅｏｎａｒｄ ｄ ｅ Ｖｉｎｃｉ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定した。
遺伝子解析
すべての個人から76末梢血EDTAサンプルの合計を収集しました。 製造業者のプロトコールに従って市販のキットを使用して末梢血リンパ球からゲノムDNAを抽出した。 HBA1およびHBA2変異の分子解析を行った。7,8簡単に言えば、多重ギャップ-ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、最初のα-サラセミア1とα-サラセミア2を含む東南アジアの集団における一般的なα-グロビン遺伝子欠失を特徴付けるために使用された;多重増幅難治性変異システムは、Hb CSとヘモグロビンPaksé（Hb PS）を含む一般的な非欠失α-グロビン遺伝子変異を検出するために行われた;そして、両方の遺伝子のすべてのコード領域およびエクソン–イントロン境界の直接DNA配列決定は、最終的に未知の非欠失α-グロビン遺伝子変異を検出す10
統計分析
推定参加者数は、α誤差0.05、有病率0.0611を設定し、80人の患者に設定することによって計算されました。 選択された変数のベースライン値は、百分位数による平均、中央値、および平均として計算された。 定量的変数の分布を、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定を用いて分析した。 パラメトリック分布を持つデータに対する対のないｔ検定とノンパラメトリック分布に対するＭａｎｎ-Ｈｈｉｔｎｅｙ検定を用いて，二つのグループ間で連続変数を比較した。 カイ二乗検定とＦｉｓｈｅｒの正確検定を使用して，パラメトリック分布とノンパラメトリック分布を持つデータのカテゴリ変数をそれぞれ解析した。 Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰＳＳ）バージョン２ ３ソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）のための統計的パッケージを統計分析に使用し、ｐ値＜ｄｉｖ ｉｄ＝”５ ６ ０ ３ ９ｄｃ９ｆ９”＞＜／ｄｉｖ＞０．
結果
患者の特徴
Phramongkutklao病院で治療された七十から六α-サラセミア患者を遡及的にレビューし、分析した。 患者の特徴を表1に示す。 五十から八患者は、Hb H病（31男性と27女性）と診断されました。 残りの18人の患者（7人の男性および11人の女性）はAE Bartの病気と診断されました。 Hb H病およびAE Bart病の患者の診断時の平均年齢は、それぞれ12.5±5.3年および10.7±5.6年であった。 平均体重および高さは36.4±16であった。Hb Hの病気の患者のための7つのkgおよび140±30cmおよびAE Bartの病気の患者のための30.2±15.2kgおよび130±21cm。 Hb H病およびAEバート病患者の平均体格指数（BMIs）は、それぞれ18.2±3.6kg/m2および17.6±3.8kg/m2であった。 Ｈｂｈ病患者とＡ Ｅ Ｂａｒｔ病患者との間には，性別，診断時の平均年齢，体重，身長，Ｂｍｉに統計的差はなかった。 Hb H病患者（55人;94.8％）のほとんどはタイ中部に居住していた。 AEバート病の患者のみ（5人の患者;27人の患者。8％）はタイ北東部に居住していた。
 
|
表1患者の特性（n=76） 注データは平均±SDまたは数値(%)として表示されます。 ｐ値は，パラメトリック分布を持つデータに対する対のないｔ検定またはカイ二乗検定と，ノンパラメトリック分布に対するＭａｎｎ-ホイットニー検定またはＦｉｓｈｅｒの正確検定から得た。 p<0.05は統計的に有意です。 略語：hb H、ヘモグロビンH。 |
Hb H病患者の臨床的特徴および検査所見を分析し、表2に記載されているように、AE Bart病患者の臨床的特徴およ 様々な血液学的データの中で、唯一の平均小体体積（MCV）と平均小体ヘモグロビン（mch）は、HB H病（60.1±9.1fLと17.8±2.7pg）AEバート病（51.6±6.3fLと15.9±1）と比較して9pg)(p<0.001および0.009、それぞれ)。
|
表2Hb HおよびAEバート病（n）の血液学的所見およびヘモグロビンタイピング注：データは平均±sdまたは数値（％）として示されています。 p値は、パラメトリック分布を持つデータのt検定またはカイ二乗検定と、ノンパラメトリック分布のマン-ホイットニー検定またはフィッシャーの正確検定から得られた。 p<0.05は統計的に有意である。 略語：CS、一定の春;Hb E、ヘモグロビンE;Hb H、ヘモグロビンH;Hct、ヘマトクリット;MCH、平均小体ヘモグロビン;MCHC、平均小体ヘモグロビン濃度;MCV、平均小体体積;N/a、利用不可;RBC、赤血球;RDW、赤血球分布幅。. |
網状赤血球数、Hba2、およびHbAは、表2に記載されているように、Aeバート病（p<0.05）と比較してHb h病患者で有意に高かった。 さらに、タンパク質、リボソーム成分、またはDNA/RNA断片を含む赤血球中の濃密な青色染色粒子である封入体は、HB H病（58.4±32.9％）の患者では、AEバート病（0.5±0.5％）の患者よりも有意に高いことが判明した（p<0.001）。
遺伝子型データ
α-グロビン遺伝子変異解析は、すべての患者で行われ、七つの異なる変異を明らかにした（表3）。 欠失変異と非欠失変異はＨ Ｂ ｈ疾患患者で等しいことが分かった。 それにもかかわらず、非欠失変異は、AEバート病（55.6％対44.4％）の患者で頻繁に発見された。
|
患者における検出されたα-グロビン遺伝子変異の表3分布（n=76） 注：3.7kbの欠失、3.7kbのα2遺伝子ヘテロ接合;4.2kbの欠失、4.2kbのα2遺伝子ヘテロ接合。 略語:CS,一定の春;Hb H,ヘモグロビンH;PS,Paksé;QS,Quong Sze; 海、東南アジアのタイプ。 |
遺伝子型および表現型の相関
Hb H疾患患者における臨床およびベースラインラボパラメータをレビューした（表4）。 Hb h疾患の患者におけるベースライン完全血球数（CBC）を見直し、ヘモグロビンレベルは、非欠失Hb h疾患（7.9±1.4g/dL）欠失Hb h疾患（9.0±1.8g/dL）（p=0.011）の患者のヘモグロビンレベルと比較して有意に低いことが判明した。 さらに、非欠失性Hb h疾患の患者は、欠失性Hb h疾患（55.9±8.8fL）の患者と比較して有意に高いMCV（64.3±7.3fL）を有することが認められた（p<0.001）。
|
表4Hb H（n=58）の臨床特性 ータは平均±sdまたは数値(%)として示されています。 ｐ値は，パラメトリック分布を持つデータに対する対のないｔ検定またはカイ二乗検定と，ノンパラメトリック分布に対するＭａｎｎ-ホイットニー検定またはＦｉｓｈｅｒの正確検定から得た。 p<0.05は統計的に有意です。略号：Hb H、ヘモグロビンH;MCH、平均小体ヘモグロビン;MCV、平均小体体積;N/A、利用できません。 |
Aeバート病患者における臨床およびベースラインラボパラメータを表5に記載のようにレビューした。 AEバート病患者の特徴は、非deletional AEバート病患者の7のうち10（70％）は、deletional AEバート病患者の1のうち8（12.5％）と比較して輸血を必要とすることを示した（p=0.025）。P>
|
表5AEバート病（n=18）の臨床的特徴 |
表5Aeバート病（n=18）の臨床的特徴 |
表5Aeバート病（n=18）の臨床的特徴 |
注：データは平均±sdまたは数値（％）として示されています。 ｐ値は，パラメトリック分布を持つデータに対する対のないｔ検定またはカイ二乗検定と，ノンパラメトリック分布に対するＭａｎｎ-ホイットニー検定またはＦｉｓｈｅｒの正確検定から得た。 p<0.05は統計的に有意です。略号：Ｈ Ｂ Ｈ、ヘモグロビンＨ；Ｈｃｔ、ヘマトクリット；ＭＣＨ、平均小体ヘモグロビン；ＭＣＨＣ、平均小体ヘモグロビン濃度；ＭＣＶ、平均小体体積；Ｎ／ａ、利用不可；ＲＢＣ、赤血球；ＲＤＷ、赤血球分布幅。 |
ベースラインCBCとヘモグロビンレベルは、非欠失AEバート病（7.7±1.1g/dL）の患者では、欠失AEバート病（9.6±0.8g/dL）の患者（p=0.001）と比較して有意に低いことが判明した。 さらに、非欠失AEバート病患者は、欠失AEバート病患者（47.0±2.8fL）と比較して有意に高いMCV（55.4±5.8fL）を有することが認められた（p=0.002）。
本研究に登録されたHb H病およびAE Bart病の58人の患者のうち、19人（25％）は輸血依存性サラセミア（TDT）群に分類され、ヘモグロビンレベルを9.5-10.5g/dLに保つために定期的な輸血が必要であった。 76人の患者（75％）のうち、非輸血依存性サラセミア（NTDT）群に分類され、通常は軽度の貧血を有し、平均ヘモグロビンレベルが7-10g/dLであり、感染などの特定の理由からヘモグロビンが減少した場合に間欠的な輸血を必要とする可能性がある。 成長パラメータもレビューし、TDTとNTDT患者の間で分析しました。 身長（p=0.41）、平均体重（p=0.37）、およびBMI（p=0.49）には、両群間に統計的差はなかった。
ディスカッション
α-サラセミアは、タイで最も一般的な遺伝性疾患の一つです。 疾患の分子病理は、α-サラセミア2または-αと呼ばれる一つのα-グロビン遺伝子の欠失、α-サラセミア1と呼ばれる二つのα-グロビン遺伝子の欠失、またはα-グロビン遺伝子（aTaまたはaaT）の特異的変異によるものであり得る。 Lalら12は、Hb H疾患を有する86人の患者を評価し、それらの患者のうち60人（70％）が欠失α-グロビン変異を有し、23人（27％）が非欠失Hb CS（aaCS）を有し、残りの3人（3％）が他の特異的な非欠失α-グロビン変異を有していたことを報告した。
α-サラセミア1およびα-サラセミア2の発生は、SEA欠失α-サラセミア1および3.7kb欠失α-サラセミア2の有病率が高い東南アジアで一般的なHb h病 また、b-グロビン遺伝子変異、特にβ eは、東南アジアでも一般的であり、タイの人口で20％-50％を占めています。したがって、Ｈ Ｂ Ｈ疾患およびヘテロ接合性Ｈ Ｂ Ｅの両方を有するＡ Ｅ Ｂａｒｔ病患者を目撃することは珍しいことではない。 Hb H病患者におけるα-グロビン遺伝子変異を同定するために遺伝子解析を行い、Hb H病患者における最も一般的なα-グロビン遺伝子変異は、HB CS（aaCS）（–SEA/aCSa）を有するSEA欠失α-サラセミア1が患者の50％を占め、次いでSEA欠失α-サラセミア1が3.7kb、右向き欠失α-サラセミア2（–SEA/-α3.7）が患者の41.3％を占めていることが示された。14
Hb H病およびAE Bart病患者におけるα-グロビン遺伝子変異の多様性は、主にタイの人口の地理的差異に起因していた。 本研究では、Phramongkutklao病院で治療された患者のほとんどがタイ中部に居住していました。 タイ型α0-サラセミアは当初、Hb h病のタイ患者で発見されたが、この研究では1人のHb H患者のうち58人（1.7％）でのみ変異が報告された。 この変異はATG>_TG(HBA2:c.1dela）は、下流のα-グロビン遺伝子発現に影響を与える可能性のある開始コドン変異である。 最近、それはタイの人口で報告されています。16私たちの患者は、このまれな変異を運ぶそれらのケースの一つである可能性があります。 本研究では，Ｈｂｈ病とＡ Ｅ Ｂａｒｔ病患者の臨床スペクトルと重症度の比較を評価した。 Hb h病の患者は、Hb H病の患者の平均MCVを報告したBoonsaらの研究に示されているように、AE Bart病（51.6±6.3fL）の患者よりも高いMCV（60.1±9.1fL）を有していた（59.6fL）はAE Bartの病気（52.6fL）とのそれらより高いです。 低ＭＣＶの病態は，サラセミア患者の細胞膜の異常から遊離グロビン鎖に続発する酸化的損傷によるものである。
ヘモグロビンタイピングは、Hb H病およびAE Bart病の患者に対しても行われた。 ＨｂｈはＨ Ｂ ｈ病患者に認められたが，ＡＥＢＡＲＴ病患者には認められなかった。 Hb H病の病因は、α-グロビンmRNAおよびα-グロビン鎖の減少または不在によるものであり、α/βグロビンmRNA比は<0である。5およびα/βグロビン鎖合成比は0.2–0.7の範囲である。 新生児期には、過剰に産生されたg-グロビン鎖はg4四量体（ヘモグロビンBart）を形成する。 成人では、過剰生産されたb-グロビン鎖はβ4四量体（Hb H）を形成し、これはヘモグロビンタイピングアッセイによって非常に少ない数で検出することができる。 したがって、追加のβ eヘテロ接合を有するAE Bart病患者の場合、ヘモグロビンタイピングアッセイからHb hを検出する可能性は非常に低く、特に低圧液体クロマトグラフィー（LPLC）のような感度の低いアッセイを使用して検出できない可能性がある。 さらに、Ｈ Ｂ Ｈ（β４）は不安定であり、酸素に対する高い親和性を有し、組織への酸素輸送がより少ない酸素を引き起こす。 従って、hb hの病気の患者で作り出される赤血球は不安定で、容易に壊れ、短い寿命があります。 さらに、Hb H病およびHb CS患者の赤血球膜は、微小循環を通過すると硬く、柔軟性が低く、細胞を損傷させる。 したがって、Ｈ Ｂ Ｈ疾患およびＨ Ｂ ＣＳを有する患者は、Ｈ Ｂ Ｈ疾患単独の患者よりも臨床的重篤度が高い。17
Hb H病患者とAE Bart病患者の臨床スペクトルの違いがこの研究で観察された。 Bowdenらによる研究で報告されているように、非欠失疾患を有する患者の臨床的重篤度は、一般に欠失疾患を有する患者の臨床的重篤度よりも重篤であ18Hb H病およびAE Bart病を含む欠失α-サラセミア病の患者の臨床的重症度が低いため、一部の患者は無症候性であり、重度の溶血を引き起こす感染症を これらの患者における臨床スペクトルの変化は、一般に、欠失および非欠失Hb h疾患の患者におけるα-グロビン産生の量の異なる結果に起因した。 α2-グロビン遺伝子は、全α-グロビン生産のほぼ3/4のα-グロビン鎖を機能させ、産生することができる。 これはα1-グロビン遺伝子によるα-グロビン産生以上のものであり、α-グロビン鎖を産生することができるのは全α-グロビン産生の1/4だけである。19
SEA欠失α-サラセミア1と3を含む本研究における欠失Hb h疾患の遺伝子型異常のほとんど。7kbまたは右方向欠失α-サラセミア2(-SEA/-α3.7)、SEA欠失α-サラセミア1 4.2kbまたは左方向欠失α-サラセミア2(-SEA/-α4.2)、および3.7kbまたは右方向欠失α-サラセミア2(-THAI/-α3.7)は、正常なα-グロビンを産生することができる機能的α-グロビン遺伝子（α1-グロビン遺伝子またはα2-グロビン遺伝子）を残していた。したがって，欠失性ｈ ｂ ｈ疾患の患者は臨床的重症度に有意差はなかった。 欠失性Ｈ ｂ ｈ疾患の患者と非欠失性ｈ ｂ ｈ疾患の患者とを比較すると，非欠失性ｈ ｂ ｈ疾患特異的Ｈ Ｂ Ｃ Ｓ患者の臨床的重症度は欠失性Ｈ Ｂ ｈ疾患の患者よりも顕著であった。 欠失Hb h病患者の残りのα-グロビン遺伝子（α2-グロビン遺伝子）は、α1-グロビン遺伝子よりも多くのα-グロビン鎖を産生する能力を有し、それによりα-グロビン鎖とb-グロビン鎖との間の不均衡を引き起こし、非欠失Hb h病患者よりも重症ではない。 これは、Ｂｏｗｄｅｎらによる研究に記載されているように、非欠失性Ｈ Ｂ ｈ疾患を有する患者と比較して、欠失性Ｈ Ｂ ｈ疾患を有する患者における臨床的重篤度が18
私たちの研究では、四人の患者が脾摘出術を受けました。 ３例は非欠失性Ｈ ｂ ｈ病，１例は非欠失性Ａ Ｅ Ｂａｒｔ病であった。 すべての患者はまた、Hb CSを有していた。 Sripichaiら20はまた、非欠失Hb CSの患者は、変異したα-グロビン遺伝子から産生される不安定なα-グロビン鎖のために臨床的重症度が高く、赤血球の破損が増加し、脾臓の大きさと輸血の必要性が増加することを報告した。
一般に、サラセミアはTDTとNTDTの2つのグループに分けることができます。 TDTの患者は通常貧血で、規則的な輸血が鉄の積み過ぎの開発の場合には鉄のキレート化の管理を用いる9.5そして10.5g/dL間のヘモグロビンのレベルを、 私たちの研究では、19人の患者がTDTに分類され、これは全患者の25％を占めていました。 NTDT患者は、通常、平均ヘモグロビンレベルが7-10g/dLで貧血が少なく、定期的な輸血を必要としない。 Fucharoen et al21およびGalanello et al22は、欠失型Hb h疾患を有する成人患者も、欠失型hb h疾患を有する成人患者よりも輸血要件が少なく、欠失型疾患を有するものよりも血清フェリチンレベルが高いことを報告した。 また，輸血を受けなかったが，血清フェリチン値の上昇を示した。 これらのメカニズムは、食事中の鉄の吸収の増加、効果のない赤血球生成、および輸血療法を有する患者の割合が高いために説明され得る。23これらの患者は鉄の積み過ぎおよび鉄のキレート化療法による組織の損傷のために密接に監視されるために推薦されます。
結論
α-サラセミアは、提示の点で非常に不均一な疾患であり、遺伝子型–表現型の相関は明らかではない。 本研究で行った分子特性評価は，診断確認だけでなく，α–サラセミアおよび複合α βサラセミア症候群のキャリア検出および遺伝子型-表現型相関にも有用である。
α-サラセミアの分化は、患者の適切な管理のために不可欠である。 軽度の臨床的特徴を有する患者の正確な診断は、不必要な輸血およびそれらの合併症を回避するであろう。
謝辞
この研究はPhramongkutklao College of Medicineによって承認され、資金提供されたものです。
この研究は承認され、資金提供されました。
開示
著者らは、この作業に利益相反は報告していません。