1Theory
オリゴヌクレオチドは、一度に一つの塩基を加え、3’から5’末端まで伸び、固相支持体に結合することによって合成される。 オリゴヌクレオチドの化学合成が完了すると、水酸化アンモニウムとのインキュベーションによってDNA鎖が固体支持体から放出される。 アンモニウムはまた、ホスホジエステル結合中のリン酸塩を保護する基を切断し、脱保護剤として作用する。 この後、熱いアンモニアを加えて、デオキシアデノシン、デオキシシトシン、およびデオキシグアノシンの環外アミノ基から保護基を加水分解する。 オリゴヌクレオチドは粗製調製物としてアンモニア溶液中で使用者に供給することができた。 この場合、使用前に、脱保護の間に生成されたオリゴヌクレオチド調製物から塩および副生成物を除去するための追加の工程を実施することが必脱保護の後、オリゴヌクレオチド調製物は、通常、脱塩され、定量され、凍結乾燥機中で蒸発乾固され、粉末の形態で使用者に供給される。
脱保護後、オリゴヌクレオチド調製物は、通常、脱塩され、定量され、凍結乾燥機中で蒸発乾固され、粉末の形態で使用者に供給される。 脱塩されたオリゴヌクレオチドの解決は全長のオリゴヌクレオチドを含んでいますが、また化学統合の間に集められた切り捨てられた生成物の混合物を含んでいます。 切り捨ては、指定されたベースが対応するサイクルでチェーンに追加できなかった場合に発生します(Hecker&Rill,1998)。 したがって、調製物中に蓄積された切り捨てられた生成物の割合は、合成効率（合成後の完全長生成物の割合）および分子の長さによって決定される。 長いオリゴヌクレオチドは、より多くのサイクルを合成する必要があり、短いオリゴヌクレオチドよりも純粋ではない。 これらの障害は、いくつかの用途において全長生成物と競合する可能性があり、オリゴヌクレオチドを使用する前に除去が必要な場合がある。 しかしながら、脱塩されたオリゴヌクレオチド調製物は、特にオリゴヌクレオチドが長さが<20ヌクレオチドである場合、標準的なPCRまたは
調製物中の全長生成物の割合が典型的には80％以下であるため、50塩基より長いオリゴヌクレオチドのさらなる精製が推奨される。
調製物中の全長生成物の割合は、典型的には80％以下である。
ゲルシフトアッセイ、部位特異的変異誘発、シークエンシング、クローニングアダプターの生産、ライブラリーの生成のための第一鎖cDNA合成など、オリゴヌクレオチドの正確な長さが重要である要求の厳しい用途には、より短いオリゴヌクレオチドに対しても追加の精製が推奨されます（タンパク質-核酸相互作用のための標準的なin vitroアッセイに関する上記の技術の詳細については、RNAおよびDNA結合および部位特異的変異誘発のためのゲルシフトアッセイを参照）。精製は、オリゴヌクレオチドの合成後または酵素修飾後に必要とされ得る。
精製は、オリゴヌクレオチドの合成後または酵素修飾後に必要とされ これを達成するためのいくつかの方法があり、その選択は、オリゴヌクレオチドの性質およびそれが意図されている用途に依存する。＜／ｐ＞＜ｐ＞逆相Ｈ ＰＬＣ精製は疎水性に基づく。＜／ｐ＞＜ｐ＞逆相Ｈ ＰＬＣ精製は疎水性に基づく。 それはanalytesを溶出させるのに移動相として非極性の静止した段階および水様の緩衝および有機溶剤を使用します;極性の混合物は非極性の混合物 これは、ビオチン、蛍光色素標識、またはNHS-エステル抱合などの疎水性基で修飾されたオリゴヌクレオチドを精製するための最良の方法である。 質量回収率はPAGE精製を使用する場合よりも高く、不完全な生成物をそれほど効果的に除去しないが、より多くの量のオリゴヌクレオチド（mmoleスケール）の精製に適している。 オリゴヌクレオチド精製カートリッジは、逆相クロマトグラフィーに基づいて、オリゴヌクレオチドを脱塩し、精製する高速な方法を提供します。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、その長さに応じてオリゴヌクレオチドを分解し、それによって、完全長の生成物を失敗した分子から区別するのに十分な分解能を提供する（Atkinson and Smith、1984）。 ポリアクリルアミドゲルは、アガロースゲルよりもDNAの小さな断片を分離するのに有効である（分析ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動によるRNAの分析を参照）。 ポリアクリルアミドゲルの唯一の欠点は、アガロースゲルよりも調製および取り扱いが困難であることである。 ポリアクリルアミドゲルは、一定の電界中で垂直配置で実行されます。 電気泳動の後で、オリゴヌクレオチドはゲルから溶離され、エタノールの沈殿物（RNAの浄化沈殿法の核酸の沈殿物の多くを見つけて下さい）または逆相クロマトグラフを使用して、集中されます。 これは完全長のオリゴヌクレオチドの最も高いパーセントが要求の適用のために望まれるとき選択の方法である。 また、30塩基以上のオリゴヌクレオチドにも強く推奨されています。 また、複数のサンプルを同時に実行することができ、高価な機器は必要ありません。 この技術の唯一の欠点は、精製ごとに得られる少量のオリゴヌクレオチドである。 典型的には、オリゴヌクレオチドは1μ mol以下のスケールで使用され、ページ精製後の質量回収率は<50％であり、修飾オリゴヌク それにもかかわらず、収率は低いが、それはほとんどの生化学的な適用のために満足である。
オリゴヌクレオチド調製物は、変性ポリアクリルアミドゲル上に、レーンあたり少なくとも1mgの量でロードされる。 ゲルの分解能の範囲は、ポリアクリルアミドの濃度に依存する。 短いオリゴヌクレオチド（15-35塩基）の場合、13-15％のポリアクリルアミドゲルが推奨され、より長いオリゴヌクレオチド（35-70塩基）の場合、8-13％のポリアクリルアミドゲルが推奨される。 ゲルの割合は、走行システムに適合させる必要があります。 私たちは通常、Bio-Rad Mini Protean IIシステムを使用し、15％ゲルを実行して長さ25塩基のオリゴヌクレオチドを精製します。 UV可視化による正しいバンドの同定の後、バンドを切除し、ゲルから抽出する。
ポリアクリルアミドゲルからオリゴヌクレオチドを精製する二つの異なる方法については、この章で説明します。 最も簡単な方法は、拡散による溶出である。 これは、より高い濃度の領域からより低い濃度の領域への分子の運動に基づいている。 拡散の結果は、材料の漸進的な混合である。 この方法は時間がかかりますが、あまりにも多くの労力や機器を必要としません。 基本的に、目的のオリゴヌクレオチドを含むポリアクリルアミドバンドは、小片にスライスされ、溶出緩衝液で覆われている。 インキュベーション後、DNAはエタノール沈殿によって上清から精製される。 収率は、オリゴヌクレオチドの長さに応じて、20％から70％の間で制限される。 使用される溶出緩衝液の量が大きいほど、より多くのオリゴヌクレオチドがゲルから拡散される。第二の方法は、透析バッグへの電気溶出である（McDonell et al., 1977). オリゴヌクレオチドを含んでいるゲルの部分は緩衝が付いている透析袋に切除され、置かれます。 電流の印加により、ＤＮＡはゲルから透析バッグ緩衝液中に移動する。 オリゴヌクレオチドはこの緩衝液から回収され、精製される。 この方法を用いると，オリゴヌクレオチドは良好な収率で単離することができるが，多数の試料を同時に精製すると時間がかかる。 この方法はまたより大きいDNAの片のためによく働き、agaroseのゲルからDNAを得るのに使用することができる。