1 Elmélet
Oligonucleotides vagy szintetizált azzal a kiegészítéssel, egy bázis, egy időben, kiterjesztve a 3′, 5′-vég, csatolva egy szilárd fázisú támogatást. Amikor az oligonukleotid kémiai szintézise befejeződött, a DNS-lánc ammónium-hidroxiddal történő inkubálással szabadul fel a szilárd tartóból. Az ammónium védőanyagként is működik, lebontva a foszfátokat védő csoportokat a foszfodiészter kötésekben. Ezután forró ammóniát adunk a védő csoportok hidrolizálásához a dezoxiadenozin, deoxycytozin és deoxyguanozin exociklikus aminocsoportjaiból. Az oligonukleotid az ammónia oldatban nyers készítményként szállítható a felhasználó számára. Ebben az esetben használat előtt szükség lehet egy további lépés elvégzésére a sók és melléktermékek eltávolítására a deprotekció során keletkező oligonukleotid készítményből.
a deprotection után az oligonukleotid készítményt általában sótalanítják, számszerűsítik, liofilizátumban szárazra párolják, és por formájában szállítják a felhasználónak. A sótalanított oligonukleotid oldat a teljes hosszúságú oligonukleotidot tartalmazza, de a kémiai szintézis során felhalmozódott csonka termékek keverékét is tartalmazza. A csonkolás akkor következik be, amikor a megadott bázis nem ad hozzá a lánchoz a megfelelő ciklusban (Hecker & Rill, 1998). Így a készítményben felhalmozódott csonka termékek százalékos arányát a szintézis hatékonysága (a teljes hosszúságú termék frakciója a szintézis után), valamint a molekula hossza határozza meg. A hosszú oligonukleotidok, amelyek több ciklust igényelnek szintetizálni, kevésbé tisztaak, mint a rövid oligonukleotidok. Ezek a hibák egyes alkalmazásokban versenyezhetnek a teljes hosszúságú termékkel, és az oligonukleotid alkalmazása előtt eltávolításra lehet szükség. A sótalanított oligonukleotid készítmények azonban általában számos alkalmazásra alkalmasak, például standard PCR vagy mikroarrays, különösen akkor, ha az oligonukleotid < 20 nukleotid hosszúságú.
50 bázisnál hosszabb oligonukleotidok további tisztítása ajánlott, mivel a készítményben a teljes hosszúságú termék százalékos aránya általában nem haladja meg a 80% – ot. Az igényes alkalmazásoknál, ahol a pontos hossza a oligonukleotid fontos, mint a gél-shift assay -, oldal-rendezés mutagenitási, szekvencia, a termelés, a klónozás adapterek, vagy az első szál cdns szintézis a generációs könyvtárak, további tisztítás ajánlott, még rövidebb oligonucleotides (bővebben lásd a fenti technikák Standard in vitro Vizsgálatokban, a Fehérje -, Nukleinsav-Kölcsönhatások – Gél shift Assay az RNS vagy DNS Kötelező, illetve Site-Rendezte Mutagenitási).
az oligonukleotid szintézise vagy enzimatikus módosítása után tisztításra lehet szükség. Ennek elérésére számos módszer létezik, a választás pedig az oligonukleotid jellegétől és az alkalmazástól függ.
a fordított fázisú HPLC Tisztítás hidrofobicitáson alapul. Nem poláris stacionárius fázist, vizes puffereket és szerves oldószereket használ mobil fázisként az analitok eluálására; a poláris vegyületeket először eluálják, míg a nem poláris vegyületeket megtartják. Ez a legjobb módszer a hidrofób csoporttal módosított oligonukleotidok, például biotin, fluoreszkáló festékcímkék vagy NHS-észter konjugációk tisztítására. A TÖMEGVISSZANYERÉS nagyobb, mint az oldal tisztításakor, és nagyobb mennyiségű oligonukleotid (mmol skála) tisztítására alkalmas, bár nem távolítja el a hiányos termékeket ilyen hatékonyan. A fordított fázisú kromatográfián alapuló oligonukleotid tisztító patronok gyors módszert biztosítanak az oligonukleotidok sózására és tisztítására.
a poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE) az oligonukleotidokat hosszuk szerint oldja fel, és ezáltal elegendő felbontást biztosít a teljes hosszúságú termékek megkülönböztetéséhez a meghibásodott molekuláktól (Atkinson and Smith, 1984). A poliakrilamid gélek hatásosabbak a DNS kis fragmenseinek elválasztására, mint az agaróz gélek (lásd az RNS elemzését analitikai poliakrilamid gél elektroforézissel és agaróz gél elektroforézissel). A poliakrilamid gélek egyetlen hátránya, hogy nehezebb előkészíteni és kezelni, mint az agaróz géleket. A poliakrilamid géleket függőleges konfigurációban futtatják állandó elektromos mezőben. Miután elektroforézis, a oligonukleotid eluálódnak a gél, koncentrált felhasználásával etanol csapadék (tudjon meg többet a csapadék a nukleinsav az RNS-tisztítás – csapadék módszerek), vagy fordított fázisú kromatográfia. Ez a választott módszer, amikor a teljes hosszúságú oligonukleotidok legmagasabb százalékát igénylik az igényes alkalmazásokhoz. Erősen ajánlott 30 bázisnál hosszabb oligonukleotidokra is. Emellett több minta is futtatható egyszerre, és nincs szükség drága felszerelésre. Ennek a technikának az egyetlen hátránya a tisztításonként kapott kis mennyiségű oligonukleotid. Az oligonukleotidokat általában 1 µmol vagy annál kisebb skálán alkalmazzák, az oldal tisztítása után a tömeg visszanyerése < 50%, módosított oligonukleotidok esetén pedig még alacsonyabb. Mindazonáltal, bár a hozam alacsony, a legtöbb biokémiai alkalmazás számára kielégítő.
az oligonukleotid-készítményt denaturáló poliakrilamid-gélre kell betölteni, sávonként legalább 1 mg mennyiségben. A gél felbontási tartománya a poliakrilamid koncentrációjától függ. Rövid oligonukleotidok (15-35 bázis) esetén 13-15% poliakrilamid gélek ajánlottak; hosszabb oligonukleotidok (35-70 bázis) esetén 8-13% poliakrilamid gélek ajánlottak. A gél százalékos arányát a futó rendszerhez kell igazítani. Általában a Bio – Rad Mini Protean II rendszert használjuk, és 15% gélt futtatunk a 25 bázisú oligonukleotidok tisztítására. A megfelelő sáv UV-vizualizációval történő azonosítása után a sávot kivágják, majd kivonják a gélből.
a poliakrilamid gélekből származó oligonukleotidok tisztítására két különböző módszert ismertetünk ebben a fejezetben. A legegyszerűbb módszer az elúció diffúzióval. Ennek alapja a molekulák mozgása a magasabb koncentrációjú régióból az alacsonyabb koncentráció egyikébe. A diffúzió eredménye az anyag fokozatos keverése. Ez a módszer időigényes, de nem igényel túl sok munkát vagy felszerelést. Alapvetően az érdekelt oligonukleotidot tartalmazó poliakrilamid sávot apró darabokra szeleteljük, majd elúciós pufferrel fedjük le. Az inkubáció után a DNS-t etanol kicsapódással tisztítjuk a felülúszóból. A hozam korlátozott, 20-70% között, az oligonukleotid hosszától függően. Minél nagyobb az alkalmazott elúciós puffer mennyisége, annál több oligonukleotidot szórnak ki a gélből.
a második módszer a dialízis zsákba történő elektroelúció (McDonell et al., 1977). Az oligonukleotidot tartalmazó géldarabot kivágjuk, és egy pufferrel ellátott dialízis tasakba helyezzük. Az elektromos áram alkalmazása miatt a DNS kivándorol a gélből a dialíziszsák pufferébe. Az oligonukleotidot kinyerjük ebből a pufferből és megtisztítjuk. Ezzel a módszerrel az oligonukleotid jó hozammal izolálható, bár időigényes, ha egyszerre nagyszámú mintát tisztítanak, mert minden egyes gélsávot be kell illeszteni az egyes dialízis zsákokba. Ez a módszer jól működik a nagyobb DNS-fragmensek esetében is, sőt felhasználható a DNS agaróz gélekből történő kivonására is.