Az IC50-szintek értékelése közvetlenül a rákellenes reagensekkel történő kezelés után, valós idejű sejtmonitorozó eszköz használatával

Bevezetés

valós idejű sejtmonitoring analízis (RTCA) rendszerelőször a tapadó sejtkultúrák folyamatos monitorozására fejlesztették ki (1). Ez a címke nélküli és nem invazív módszer az interdigitált régiók közötti elektromosság (sejtindex, CI) mérésén alapul a szövetkultúra lemezein. A CI mérés biztosítjakvantitatív információ az adherentcellák biológiai állapotáról. Valójában a CI jelentése a túlélési sejtek számaaz E-lemez felületén. Ezek az adatok magukban foglalják a sejtszámot,az életképességet és a morfológiát, mint valós idejű profilt (2-4). RTCAsystem ismert, hogy a korai felismerő eszköz a sejt reakció, mint adynamic fenotípus ellen egyes reagensek (5).

korábbi vizsgálatunkban az oralsquamous cell carcinoma (OSCC) imatinib citotoxicitását a WST alkalmazásával értékelték-8(5– 3-(2- Metoxi – 4-nitrofenil)- 2-(4-nitrofenil)-2H – tetrazol – 3 – ium) vizsgálati mint anendpoint mérés (6), majdlater RTCA rendszerrel (7).Az MTT (3–2,5-difenil-tetrazolium-bromid) és a WST-8 vizsgálatok végpontmérései csak a citotoxicitás értékelésére szolgálnak. Az ilyen vizsgálatokat azonban a különböző rákellenes szerek hatásainak eltérései korlátozzákkülönböző sejtvonalakon. Továbbá az in vitro végpontvizsgálatokkal kiszámított IC50 értékek általában magasabbak, mint az in vivo effektív koncentrációk (8,9).

korábbi vizsgálatunkban az RTCA rendszer által mért IC50 értékek alacsonyabbak voltak, mint a WST-8 vizsgálat által mért értékek, ami arra utal, hogy az RTCA rendszer érzékenyenértékelheti a citotoxicitást és az imatinib hatását a celladhesionra. Nem világos azonban, hogy az RTCAsystem-et használó más rákellenes szerek eic50 értékeinek értékelése hasznos lenne, mivel a molekuláris célzott gyógyszerek, például az imatinib és a daganatellenes szerek között idővel különbségek vannak a citotoxikreakciókban.

ebben a vizsgálatban ki kell választanunk bizonyos típusú sejtvonalakat annak érdekében, hogy meghatározzuk a sejtreakciók különbségétprofil a rákellenes reagensekkel szemben valós időben RTCA rendszer segítségével.Nem invazív SQUU-a sejtvonal és invazív SQUU-B sejtvonal, amelyaz asingle betegben lokálisan visszatérő nyelvrákos daganatokból alakult ki, azért választottuk ki, mert a SQUU-B sejtvonal metasztázisát kutattuk a SQUU-a sejtvonal és a SQUU-BCELL vonal (10-12) segítségével. A sas sejtvonalat a következők alapján állapították meg: nagymértékben differenciált humán laphámsejtes karcinóma a nyelvben(13). A na sejtvonalat fibronektin-termelő sejtvonalként hozták létre (14). Továbbá arról számoltak be, hogyaz OSCCC-ben a rákellenes reagensek citotoxicitását a SQUU-a sejtvonal és a SQUU-B sejtvonal (15), A SAS sejtvonal (16), a NA sejtvonal (17) különböző hagyományos módszerekkel értékelték.Ezért választottuk ki ezeket a sejtvonalakat mindegyikkeljellemző jellemzője a jelen tanulmányban, amelyet a korábbi vizsgálatban citotoxikus vizsgálatban is használtunk.

ebben a tanulmányban egy új, valós idejű mérésre kifejlesztett RTCA-készülékre koncentráltunk, és a cytotoxicitást négy OSCC-sejtvonalban értékeltük. Ez lehetővé tette számunkra, hogy a különböző rákellenes reagensekkel és sejtvonalakkal kapcsolatban megfigyelt változásokról időben tájékoztatást kapjunk.

a jelen tanulmány célja az volt, hogy az RTCA-rendszert használó daganatellenes szerek hozzáadása után azonnal megszerezze az 50 profilt. Ez a vizsgálat kimutatta, hogy az RTCA rendszert használó rákellenes szerek citotoxicitásának értékelése előnyösebb, mint egy végpontvizsgálat.

anyagok és módszerek

reagensek és anyagok

5-Fluorouracil (5-FU) 100 mM-es indimetil-szulfoxidra (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA).A doxifluridint és a karboplatint 100,illetve 50 mM-re hígítottuk desztillált vízben. A docetaxelt 10 mM-es inetanolra hígítottuk. Az összes rákellenes reagenst a Wako Purekémiai Industries, Ltd., (Oszaka, Japán) és -20°C-on tárolva.

sejtkultúra

emberi OSCC sejtvonalak SQUU-a, SQUU-B, SAS, és nawere származó emberi nyelv minták. A SQUU – a-T és a SQUU-B-t a Morifuji-Wilson M (Kumamoto Egyetem,Kumamoto, Japán) helyi tonguecancer tumorokból (18) hozták létre. SAS (13,19,20) voltvásárolt a Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japán). NA (14) kedvesen biztosította Dr. Jun-ichi Iwata (Kyushu Egyetem; Fukuoka, Japán). A Dulbecco módosított Eagle ‘ s medium (DMEM;Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japán), amely 10% magzati borjúszérumot(Biowest, Nuaille, Franciaország) tartalmaz 37°C-on nedvesített légkörben, 5% CO2-vel.

az OSCC sejtproliferáció MÉRÉSEAZ RTCA citotoxicitási vizsgálattal

A CI-t az iCELLigence rendszer (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, USA) mint RTCA rendszer. Az allmonitoringot 37°C-on végezték szabályozott CO2-Veltartalmat (5%). A kútonként 200 µl tápközeget tartalmazó E-lemezeket (az iCELLigence-rendszer tenyészetlapjait) 37°C-ra egyenlítettük ki, a CI-t pedig ilyen körülmények között nullára állítottuk. A sejteket (eltérő rendelkezés hiányában 2×104 sejt/kút) 560 µl tenyészetben közepes rákellenes szerekkel egészítették ki 24 órával a sejtek táplálása után. A CI-t valós időben megfigyelték 96 órán át a vetés után. Az IC50 értékeket az RTCAData Analysis Software version 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

négy antikancerreagens nyolcpontos koncentrációját az előző vizsgálatban(21-25) mért Cmax értékek alapján határozták meg. Továbbá, az idő pontokat setduring 72 h beleértve 24 h 48 h, amelyek általános módszer toevaluate citotoxicitás a végpont vizsgálat.

az IC50data

görbe illesztése az IC50 értékek kiszámításához a következő szigmoid dózis-responseformulát használtuk: Y=alacsony CI + (HighCI-Low CI)/{1+10 ^ (log IC50-X)}, ahol az “alacsony CI” a minimális CI értéket képviseli, a “High CI” a maximumcell index értékeket, Y a sejtindex, X pedig a concentration (M) naplója.

az OSCC sejtek proliferációjának Mérésea WST-8 vizsgálatban

az OSCC sejtek kezdeti vetését és tenyészetét követően a tenyészközeget eltávolítottuk,és antikanceragens tartalmú közeggel helyettesítettük. 24, 48 és 72 órás inkubálás után 20 µl WST-8 festéket (Cellaszámoló készlet-8; Dojindo Corporation, Tokió, Japán) adtak minden kúthoz. 3 óra elteltével a lemezeket olvasták450 nm / 655 nm. A sejt túlélési arányát az alábbi (7) képlet alapján számítottuk ki. Az IC50 értékeket a percentage túlélés lineáris közelítő regressziójával számítottuk ki a gyógyszerkoncentrációhoz képest.

sejt túlélési arány (%) =(a-c)/(b-c) ×100 (a=abszorbancia a rákellenes reagens minden koncentrációjánál,b=abszorbancia a rákellenes reagens 0 µM-nél, és c=a blank abszorbancia).

statisztikai elemzés

az összes adat három független kísérlet átlagos ± szórásaként(SD) jelenik meg. Az RTCA rendszerrel kapott 50 érték és a WST-8ASSAY közötti összefüggéseket a Spearmantest statisztikai szignifikanciára értékelte. A p<0, 05 Kétfarkú értékeit jelentősnek tekintették.

Eredmények

Hatása a rákellenes agentconcentration a OSCC sejtosztódás segítségével tesz az rtca rendszer

értékeltük a citotoxicitás négy anticancerreagents (5-FU, doxifluridine, karboplatin, illetve a docetaxel) a fourOSCC sejtvonalak figyelemmel kíséri a CI értékek 96 h után thecells szétszórták a 2×104 sejt/nos, az E-rendszám(Füge. 1–4). A CI-értékek mind a négy OSCC-sejtvonalban adóz-függő módon csökkentek. Ezért a CI-értékek csökkenése korrelált a sejt csökkenésével number.As ábrán látható. 2, A CI érték forinvazív SQUU-B sejtvonal alacsonyabb volt, mint a többi OSCC cells.As ábrán látható. 3, CI profileobtained SAS sejtvonal mutatott késleltetett növekedése után 48 h. Asshown ábra. (4) A NA sejtvonalban a proliferáció és a maximális CI érték aránya magasabb volt, mint más sejtvonalakon.

az OSCCC sejtekben található rákellenes szerek 50 profiljának valós idejű méréseaz RTCA rendszer

a négy OSCCC sejtvonal négy rákellenes ágensének IC50 profilját az RTCAsystem határozta meg, és a theinstrumenthez mellékelt kereskedelmi szoftver segítségével számította ki (a SQUU-B adatok egy részhalmaza az ábrán látható. 5). Az IC50 értékeket a rákellenes szerek hozzáadása után 72 órán át ábrázolták. A 24, 48 és 72 órás érték mind a négy cellás vonal esetében az I–IV. táblázatban található. 5, időeltolódás volt a citotoxikában5-FU reakciói (ábra. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Míg a WST-8-as vizsgálattal a cella életképességi görbéit kiegészítő anyagokban(füge) is kimutatták. S5-S8). A WST-8 vizsgálatban alkalmazott 72 órás R2 értékek alacsonyak voltak a 24 órás és a 48 órás teszthez képest. ezek az eredmények azt mutatták, hogy kívánatos, hogy a 24 órás vagy 48 órás végpontvizsgálatot általános protokollként alkalmazzák. Ebben a tanulmányban a WST-8 vizsgálat sejt életképességi görbéit mutattákfeltételes anyagok, mivel nem volt újdonság az IC50 értékek kiszámításában a WST-8 vizsgálat segítségével.

korrelációk az IC50 értékek valós idejű mérései között az RTCA rendszer használatával és az IC50 értékek végpontmérései a WST-8assay használatával OSCC cellákban

Az ábrán látható módon. 6, IC50 értékek 24, 48, 72 h két módszerrel voltplottált. A vízszintes tengely valós idejű IC50 értékeket mutataz RTCA rendszerrel mérve, míg a hossztengely a WST-8 assay segítségével mért IC50 értékeket mutatja. Apostitív korrelációt figyeltek meg a kétféle vizsgálat közöttmódszer az IC50 mérésére minden rákellenes szer esetében.Az eredmények az 5-FU, doxifluridine, karboplatin, valamint docetaxcelwere y=8.19 x+346.02 (R2=0.94,rs=0.66, *P<0.05), y=1.00 x+172.70(R2=0.91, rs=0.82, **P<0.01),y=1.90 x+206.81 (R2=0.92,rs=0.96, **P<0.01), andy=13.53 x+0.08 (R2=0.95,rs=0.73, *P<0.05), ill. A valós idejű 50 értékek általában alacsonyabbak voltak, mint a megfelelőekendpoint IC50 értékek.

az RTCA által kiszámított CI értékek szintén a cella állapotát mutatják (3). Fügébe bújva. 1-5, A CI értékek SD értékei túl kicsiek voltaklásd. Például az összes SD érték az ábrán.1 alatt voltak 0.05. A SQUU-B alacsony CI-értékeinek oka az voltjavasolta, hogy az e-cadherin adhéziós fehérje lényeges szerepet játszik a metasztázisban, csökkent e-cadherin szinttel, elősegítve a sejtek migrációját (26). Az ofNA magas maximális CI-értékeinek oka arra utal, hogy a fibronektinaccelerált sejtproliferáció és adhézió a sejtvonal fibronektint termelő sejtvonalként (6) jellemző tulajdonsága miatt jelentkezett. Így az egyes sejtvonalak sejtreakcióia négy rákellenes reagens ellen változó volt. Ebben a tanulmányban nem találtuk meg az IC50 értékek és a sejtvonalak érzete közötti ok-okozati összefüggést. Fontos azonban, hogy egy sejtreakciót valós időben CI-profilként határozzunk meg a rákellenes reagens thecytotoxicitásának értékelésére, ha figyelembe vesszük a gyógyszerészetetalkalmazás az emberre.

A SQUU-B cellavonal IC50-profilját a következő ábrán írtuk le. 5 mivel arepresentative IC50 profil, mert voltak nodifferences IC50 profil minta ugyanabban a sejtvonalban incase azonos reagens, bár számítottuk IC50 valuesin minden sejtvonal segítségével négy rákellenes reagensek. Azt találtuk, hogy a teic50 profilok változott minden rákellenes szer és ineach OSCC sejtvonal. Amint az ábrán látható.5, 5-FU, illetve a docetaxel szükséges több, mint 24 óra (48 h thefigure), hogy a start gyakorolt citotoxikus hatása a OSCC sejtek,mivel az IC50 értékek kiheverte 24 h(48 h a ábra) hozzáadása után doxifluridine andcarboplatin. Így azt javasoltuk, hogy a valós idejű különbségek50 profilok okozta rákellenes reagens. Az ilyen beavatkozások valós idejű mérés nélkül nem lettek volna lehetségesek az RTCA használatával. Az eic50 értékek valós idejű nyomon követése azt is feltárta, hogy ezek az értékek idővel jelentősen megváltoztak. Lehetőség van arra, hogy ne észleljükváltozások hagyományos módszerekkel, mert az IC50 csak egy időpontját a rákellenes szerrel végzett kezelés után végpontvizsgálattal értékelik.

az RTCA rendszer ellentétben áll a hagyományos endpointassay-kkal, mivel az impedancia mérése nem invazív éskiváló minőségű, kvantitatív adatokat szolgáltathat a citotoxicitásról akontinuális módon. Amint az ábrán látható.6, jelentős pozitív korrelációk voltak az RTCA rendszerrel és a WST-8assay-val kapott 50 érték között, annak ellenére, hogy a CI abszolút értékei között voltak különbségek, például a SQUU-B cellavonalhoz kapott alacsony CI értékek. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy néhány sejtvonal esetében még egy alacsony CI is képes lenne értékelni az RTCAsystem nagy érzékenységű citotoxicitását. Míg a valós idejű IC50 értékek alacsonyabbak voltakendpoint IC50 értékek, amikor az RTCA rendszerrel kapott valós idejű IC50 értékeket összehasonlították a WST-8 teszttel kapott Endpoint IC50 értékekkel.Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az RTCA rendszer használhatóérzékeny módon értékeli a rákellenes szerek hatását a sejtproliferációra és tapadásra.

az RTCA rendszerben a tapadó sejt szigetelőként működik az elektróda felületén, és megváltoztatja az elektród oldat Ionos közegét, növelve az impedanciát (27). Így a CI a sejt funkciójaa sejtek száma és aránya különböző időintervallumokban. CI=0, amikornincs sejt tapadás (5). CICHANGES által leírt RTCA rendszer tükrözi dinamikus fenotípus ofcell. A sejt-gyógyszer interakció dinamikus monitorozása lehetővé teszihogy jobban megértsük az Invitro időbeli hatásait, különösen közvetlenül a gyógyszeres kezelés után(28). A thecells kinetikus tulajdonsága olyan éleslátó információkat kínál, amelyeket nem lehet megszerezni az aconvencionális egypontos vizsgálatból, például a WST-8 vizsgálatból. Míg a WST-8 vizsgálat eredményei a survivalcell (29) metabolikus reakcióját tükrözik. A WST-8assay-t alkalmazó toxicitás alábecsülhet, ha a sejt metabolikus reakciója dinamikus sejtreakció volt. Azt javasoltuk, hogy a két módszerben a megbízó különbségei az IC50 érték nagy különbségeit indukálják, akár 8-szor két metódus között, amint az az ábrán látható. 6A. korábbi Vizsgálatunk arról számolt be, hogy az Imatinib IC50-je SQUU-Acellekben az RTCA rendszer alapján számított, a WST-8 vizsgálat pedig 4 µM, illetve 60µm (15-szeres érzékenység) (6,7) volt. Más kutatócsoportok arról számoltak be, hogy a ciszplatin IC50-e HK-2CELLÁKBAN az RTCA rendszer és a WST-8 vizsgálat alapján számított értéke 0,76 µM, illetve 25 µm volt (33-szoros érzékenység) (30,31).Ezek a korábbi adatok támogatták az adatainkat az érvényesség megjelenítéséhez.

fontos, hogy méréseket kapjonazonnal a rákellenes szerekkel végzett kezelés után, hogy felmérje mind a hatóanyagok mellékhatásait, mind a kívánt hatásokat. Azonban kevés olyan hasznos módszerről van szó, amely korrelálja az invitro adatokat az emberi in vivo adatokkal. Úgy gondoltuk, hogy az RTCA-rendszert használó valós idejű mérés jót tenne a rákellenes szerek mellékhatásainak a normalcellákban történő értékelésében.

korábban jelentett Cmax értéke 5-FU,doxifluridin, karboplatin és docetaxel 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), humán intravénás kezelés esetén 2 µM (24,25). Ourdata korrelált az emberi adatokkal, mivel a Cmaxértékek bekerültek az ebben a vizsgálatban alkalmazott kísérleti dózisok tartományába.

az RTCA rendszerek az új fő eszköz a citotoxicitás értékeléséhez, amelyek a celladhesion impedancia intenzitását alkalmazzák, nem pedig az enzimaktivitást a célsejtekben, például az MTTassay-ben. A rákellenes szerek IC50 értékei, amelyeket aaz RTCA rendszer jelentősen korrelált a hagyományos végpontvizsgálattal kiszámított IC50 szintekkel. Továbbá, az RTCA rendszer kapott méréseket automatikusan valós időkeretben közvetlenül a kezelés után rákellenes szerek.

valójában az RTCA rendszer nem tudja közvetlenül értékelni a citotoxicitást,például a sejthalált vagy az apoptózist stb., Mivel a sejtindexet impedancia alapján számították ki. Ezért az RTCA-rendszer és a sejthalálmérés közötti kombinációs vizsgálat hatékony módszer lehet a konkrét sejtreakció, például sejthalál vagy apoptózis pontos értékelése esetén.Például, Annexin v festés vagy expressziója kaszpáz-3 assay kimutatására apoptózis, laktát-dehidrogenáz (LDH) releasay kimutatására sejthalál lehet hatékony módszerek(32,33). Továbbá hasznos lehet a normál sejtekben a gyulladásos fehérje expressziójának értékelése, ha rákellenes reagenst adnak az E-lemezre vetített sejtekhez. Dinamikus, valós idejű monitorozás a sejtkultúra során, beleértve a rákellenes reagenseket is, értékes információkat nyújthat a terápiás hatékonyság és a mellékhatáshatás korai felismeréséhez, amelyeket a hagyományos módszerekkel nem lehet A végpontvizsgálatban értékelni. Tehát az RTCA rendszer által kiszámított IC50 érték hasznos lehet olyan paraméterekhez, mint például a szűrés a valós idejű mérés szempontjából automatizált, a colorimetricallyproblems vagy a szennyeződés elkerülése. Ezenkívül az RTCA rendszer lehetővé teszia kísérlet teljes időszakának elemzését, és nem igényel olyan címkézést, amely negatívan befolyásolhatja a sejtkultúrátkísérletek.

a tanulmány újdonsága, hogy az RTCA rendszer nagy érzékenységgel képes citotoxicitást kimutatni a hagyományos WST-8 vizsgálathoz képest. Ezenkívül az RTCA rendszer valós időben, kísérleti időszak korlátozása nélkül, legalább 72 órán keresztül, ananticancer-reagensek hozzáadása után, precízen értékelheti azic50 értéket.

összefoglalva, eredményeink azt mutatták, hogy az RTCAsystems hasznos a citotoxicitás vizsgálatára, és felhasználható kemoterápiás szerek infuture kifejlesztésére ráksejtekés a mellékhatások értékelése a normál sejtekben. Ezenkívül RTCA-rendszer használható a rákellenes reagensek sejtreakciós profiljainak,például kombinált terápiának, antitest-sejtnek vagy gyógyszer-gyógyszerinterakcióknak a értékelésére.

Kiegészítő anyag

támogató adatok

elismerések

nem értelmezhető.

finanszírozás

nem érkezett finanszírozás.

adatok és anyagok rendelkezésre állása

a jelen tanulmány során használt és/vagy elemzett adatkészletek a megfelelő szerzőtől a reasonablequest oldalon érhetők el.

A szerzők hozzászólásai

MH és MN megfogalmazták és megtervezték a tanulmányt. Az MH andTN elvégezte a kísérleteket és megszerezte az adatokat. Az MH elemezte az adatokat, elkészítette a számokat, és elkészítette a kéziratot. MH, TKY andMN értelmezte az eredményeket. Az MH és a TKY szerkesztette és átdolgozta a themanuscriptet. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a véglegesetmanuscript.

etikai jóváhagyás és beleegyezés toparticipate

nem alkalmazható.

beteg hozzájárulása a közzétételhez