a célzott homing endonukleázok erejének kihasználása érdekében a Jerome lab egy hasznos szállítási rendszer optimalizálásán dolgozott mind in vivo, mind in vitro vizsgálatokban. Adeno-asszociált vírus (AAV) szállítórendszert használtak az egér trigeminális ganglionjainak megcélzására a két HSV specifikus endonukleáz bármelyikével: a HSV1M5, amelynek célja a virion protein VP5 gén hasítása, valamint a HS1M8 ,amely a DNS polimeráz katalitikus alegységet kódoló gént célozza meg. Ezeknek a géneknek a mutációinak létrehozása a vírusgenom megzavarását okozza, és megakadályozza a virion termelését. A Trex-2 kezelés hatásainak további növelése érdekében egy 3′ -5 ‘ endonukleázt, amelyről kimutatták, hogy növeli az irányított mutagenezist, egyidejűleg transzducálták. A rendszer létrehozása után a labor in vitro munkát kezdett, amely a neuronokra, a biológiailag releváns sejttípusra összpontosított. A neuronok tenyészeteit HSV1m5 vagy 8 és Trex-2-vel együtt transzdukálták, majd HSV-vel fertőzték meg. A kezelt tenyészetek a vírus titer 50% – os csökkenését, valamint a mutációk jelenlétét mutatták a HSV-ben a T7 endonukleáz 1 vizsgálattal és a klonális szekvenálással. A lytic fertőzés megzavarása után a kutatók elkezdték vizsgálni a HSV fertőzés különböző szakaszaira gyakorolt hatásokat. A HSV-vel fertőzött neuronok tenyészeteinek felhasználásával, majd a hsv1m5 vagy 8 Trex-2-vel különböző időpontokban történő kezelésével a kutatók szimulálhatják a fertőzés különböző szakaszait. A tenyészeteket 7 napon (akut fázis), 14 napon (késői akut/ korai látens fázis) és 32 napon (látens fázis) kezelték, és a vírusfázistól függetlenül a hatás nem változott. Ez arra utal, hogy a HSV hasonlóan érzékeny az endonukleáz mutagenesisre, függetlenül a vírusfázistól. A célhely mutációk szintje 4,5-7,6%, a hsv1m5 és a HSV1m8 esetében pedig 1,1-6,6% volt. Jelenleg ez az első tanulmány, amely az endonukleáz aktivitást vizsgálja a latens fertőzött neuronokban.
Az in vitro eredmények alapján a kutatók in vivo vizsgálatokat végeztek HSV-vel fertőzött egerekkel, majd 32 nappal később az AAV (hsv1m5 vagy 8 és Trex-2) injekcióval. Az egerekből származó neuronokat 30 nappal az AAV injekció beadása után vették fel vírus titer, vírusterhelés és HSV genommutációk céljából. A csoport 1-2% mutációt mutatott 2/4 egérben a HSV1m5 esetében, 3/4 egérben a HSV1m8 esetében. Azonban ezeknek az állatoknak a vírusterhelése hasonló volt a kontroll és a kezelt állatok között. A kezelt állatokban egy nappal elhalasztották a vírusürítést, de idővel hasonló szintet értek el a kezeletlenhez képest. Az eredmények tükrében Dr. Jerome azt mondta: “ez az első alkalom, hogy egy állatban tényleges látens vírusfertőzést állapítottak meg, majd részben, endonukleáz-terápiát alkalmazva letiltották. Tehát kritikus lépést jelent az ilyen terápiák emberi alkalmazáshoz való eljuttatása felé. A fő kihívás most a terápia hatékonyságának növelése, így a látens vírus egésze vagy szinte mindegyike genetikailag le van tiltva. Újabb, hatékonyabb nukleázokat vizsgálunk, mint például a CRISPR / Cas, és értékeljük az új módszereket a nukleázok bejuttatására a fertőzött neuronokba in vivo.”A jövőben ez a terápia új gondolkodásmódot eredményezhet olyan látens betegségek kezelésében, mint például a HSV és a HIV, amelyeket jelenleg gyógyíthatatlannak tekintünk.
a kutatás finanszírozását a National Institutes of Health és a Canadian Foundation biztosította.
Aubert M,Madden EA,Loprieno M,DeSilva Feelixge HS,Stensland L, Huang ML, Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret A,Galleto R,Stone D, Jerome KR. 2016. A látens HSV in vivo megzavarása a tervező endonukleáz terápiával. JCI Insight, 1(14).