| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structures: | pfam | PDB | pdbsum | |||
taq Pola on yleisrakenteeltaan samanlainen kuin E. coli Pola. Keskimmäinen 3′ -5 ’ – eksonukleaasialue, joka vastaa oikoluvusta, on muuttunut dramaattisesti, eikä se ole toimiva. Sillä on funktionaalinen 5′-3’ – eksonukleaasi-domeeni alla kuvatussa aminoterminaalissa. Loput kaksi verkkotunnusta toimivat koordinoidusti kytketyn verkkotunnuksen liikkeen kautta.
Eksonukleaasi domainEdit
Taq-polymeraasi eksonukleaasi on domeeni, joka esiintyy Taq-DNA-polymeraasi I: n aminoterminaalissa (termostabiili). Se olettaa ribonukleaasi H: n kaltaisen motiivin. Domeeni antaa polymeraasille 5′ -3 ’ – eksonukleaasiaktiivisuuden.
toisin kuin E. coli-bakteerin sama domeeni, joka hajottaisi alukkeita ja joka on poistettava pilkkoutumalla PCR-käyttöä varten, tämän domeenin ei sanota hajottavan aluketta. Tätä toimintaa käytetään TaqMan-luotaimessa: tytärsäikeiden muodostuessa sapluunaa täydentävät koettimet joutuvat kosketuksiin polymeraasin kanssa ja pilkkoutuvat fluoresoiviksi kappaleiksi.
sitoutuminen Dnaeditin kanssa
Taq-polymeraasi sitoutuu polymeraasin aktiivisen kohdan halkeamaan duplex-DNA: n tylppään päähän. Taq-polymeraasin joutuessa kosketuksiin sitoutuneen DNA: n kanssa sen sivuketjut muodostavat vetysidoksia DNA: n puriinien ja pyrimidiinien kanssa. Sama DNA: han sitoutunut Taq-polymeraasin alue sitoutuu myös eksonukleaasiin. Näillä Taq-polymeraasiin sitoutuneilla rakenteilla on erilaisia vuorovaikutuksia.
MutantsEdit
on raportoitu paikkaan suunnatusta mutageneesikokeesta, joka parantaa surkastuneen 3′-5′ eksonukleaasiaktiivisuutta kertoimella 2, mutta ei ole koskaan raportoitu, vähentääkö tämä virhetasoa. Samantapaisen ajattelutavan mukaan Chimera-proteiineja ovat valmistaneet E. coli -, Taq-ja T. neapolitana-polymeraasi I. surkastuneen domeenin vaihtaminen funktionaaliseen E. coli-domeeniin loi proteiinin, jolla on oikolukukyky, mutta alhaisempi optimaalinen lämpötila ja alhainen termostaattiherkkyys.
polymeraasista on tuotettu versioita ilman 5′-3′ – eksonukleaasi-domeenia, joista klentaq tai Stoffel-fragmentti tunnetaan parhaiten. Eksonukleaasiaktiivisuuden täydellinen puuttuminen tekee näistä muunnoksista sopivia alukkeille, joilla on sekundaarirakenne, sekä pyöreiden molekyylien kopiointiin. Muita muunnelmia ovat klentaqin käyttäminen hifi-polymeraasilla, Termosekvenaasi, joka tunnistaa substraatteja, kuten T7-DNA-polymeraasi, mutantit, joilla on suuremmat toleranssit inhibiittoreille, tai ”domain-tagged” – versiot, joissa on ylimääräinen helix-hiusneula-helix-motiivi katalyyttialueen ympärillä pitääkseen DNA: n tiukemmin epäsuotuisista olosuhteista huolimatta.
merkitsevyys taudin havaitsemisessa edit
PCR-DNA-replikaatiossa saavutettujen parannusten vuoksi Taq-polymeraasi: suurempi spesifisyys, vähemmän epäspesifisiä tuotteita ja yksinkertaisempia prosesseja ja laitteita, se on ollut keskeisessä asemassa pyrkimyksissä havaita sairauksia. ”Polymeraasiketjureaktion (PCR) käyttö tartuntatautien diagnosoinnissa on johtanut kykyyn diagnosoida varhain ja hoitaa asianmukaisesti taudinaiheuttajien aiheuttamia sairauksia, määrittää hitaasti kasvavien organismien mikrobilääkeherkkyys ja selvittää infektion määrä.”Taq-polymeraasin käyttöönotto on pelastanut lukemattomia ihmishenkiä. Sillä on ollut keskeinen rooli monien maailman pahimpien tautien, kuten tuberkuloosin, streptokokin aiheuttaman nielutulehduksen, epätyypillisen keuhkokuumeen, aidsin, tuhkarokon, hepatiitin ja haavaisten urogenitaalisten infektioiden, havaitsemisessa. PCR-menetelmä, jota käytetään tiettyjen DNA-näytteiden kopioiden uudelleenluomiseen, mahdollistaa taudin havaitsemisen kohdentamalla potilaan näytteestä kohdennetun patogeenin tietty DNA-sekvenssi ja vahvistamalla ohjeellisten sekvenssien jäämiä kopioimalla niitä jopa miljardeja kertoja. Vaikka tämä on tarkin menetelmä taudin toteamiseksi, erityisesti HIV: n osalta, sitä ei suoriteta niin usein kuin vaihtoehtoisia, huonompia testejä, koska se vaatii suhteellisen korkeita kustannuksia, työvoimaa ja aikaa.
tukeutuminen Taq-polymeraasiin PCR-replikaatioprosessin katalyyttinä on korostunut COVID-19-pandemian aikana vuonna 2020. Pula tarvittavasta entsyymistä on heikentänyt maailman maiden kykyä valmistaa testipakkauksia virusta varten. Ilman Taq-polymeraasia taudin toteamisprosessi on paljon hitaampi ja työläs.
huolimatta Taq-polymeraasin käytön eduista PCR-taudin toteamisessa entsyymi ei ole vailla puutteitaan. Retroviraaliset sairaudet: HIV, HTLV-1 ja HTLV-II; sisältävät usein mutaatioita guaniinista adeniiniin niiden genomissa. Tällaiset mutaatiot mahdollistavat PCR-testien avulla sairauksien havaitsemisen, mutta Taq-polymeraasin suhteellisen alhainen uskollisuusaste saa aikaan saman G-A-mutaation ja antaa mahdollisesti väärän positiivisen testituloksen.