the EXPERIMENT
As presented in the problem‐solving test in the last issue of Biochemistry and Molecular Biology Education , the transkription unit encoding the enzymes of Tryptophan biosynthesis is regulated by the trp1 repressor: korepressorina toimiva tryptofaani sitoutuu repressoriin ja aktivoi sen, joka puolestaan sitoutuu operaattorin alueeseen ja estää RNA-polymeraasin liikkeen ja siten transkription tryptofaanisynteesin entsyymien rakenteellisista geeneistä trp E, D, C, B ja A. Tämä inhibitio on kuitenkin” vuotava”: operonia transkriptioidaan jonkin verran jopa tryptofaanin läsnä ollessa; tämä tuhlaisi energiaa sellaisten entsyymien tuottamiseen, joita ei tarvita. Toinen säätelymekanismi, jota kutsutaan vaimennukseksi, kaataa tämän TRP-operonin jäljelle jääneen transkription .
lyhyt alue operaattorin ja ensimmäisen rakenteellisen geenin (trp E) välillä, jota kutsutaan leaderiksi (Kuva. 1), vastaa vaimennuksesta. Leader-sekvenssi on ∼140 basepairin pituinen ja koodaa TRP mRNA: n 5 ’ – loppuisen alueen ennen ensimmäisen rakenteellisen geenin initiaatiokodonia. TRP mRNA: n leader-alueella on ainutlaatuinen rakenne (kuva. 2 a). Se sisältää lyhyen avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodaa leader-peptidiksi kutsuttua oligopeptidia. Kaksi palindromisekvenssiä (alue 1/2 ja alue 3/4) tuottavat itseään täydentäviä basepairingeja, jotka johtavat hiusneulan rakenteiden muodostumiseen. Toista hiusneulaa (alue 3/4) seuraa ME: n venytys, joka luo rakenteellisen ominaisuuden tietyille transkription terminaattoreille. Leader-peptidin ORF-koodaus on päällekkäinen alueen 1 kanssa ja sisältää kaksi tryptofaanin kodonia. Lisäksi alueet 2 ja 3 täydentävät toisiaan paitsi alueita 1 ja 4 myös toisiaan. Tämä leader-sekvenssin melko monimutkainen rakenne luo perustan nerokkaalle säätelymekanismille operonin transkriptiota varten.
Fig. 1. E. colin tryptofaani-operonin rakenne.(P, promoottori; O, operaattori; L, johtaja; E, D, C, B ja A, rakenteelliset geenit. Lukua ei ole piirretty mittakaavaan: P -, O-ja L-alueet ovat paljon lyhyempiä kuin proteiinia koodaavat geenit.)
Fig. 2. E. coli-bakteerin trp-operonin säätely heikkenee. (a) TRP mRNA: n 5’‐loppuisen alueen rakenne. b) vaimennuksen lieventäminen vähäisessä tryptofaanialustassa. (c) TRP‐transkription varhainen Päättyminen (vaimennus) korkea-tryptofaanialustassa (tarkemmat tiedot, ks.teksti).
vaimennus perustuu kytkettyyn transkriptioon / translaatioon prokaryooteissa: ribosomit sitoutuvat orastaviin mrnoihin muodostaen kromosomi–polysomikomplekseja; näin proteiinisynteesi alkaa kasvattaa mRNA-ketjuja. Jos tryptofaania ei ole saatavilla (Kuva. 2B), ribosomi pysähtyy johtavassa peptidissä koodaten Orfeja, jotka häiritsevät hiusneulaa 1/2 ja johtavat hiusneulan muodostumiseen 2/3. Tämä hiusneula estää päättymisneulan 3/4 (jota kutsutaan vaimentimeksi) syntymisen, ja näin RNA‐polymeraasi pystyy jatkamaan venymistä ja transkriboi koko operonin täysimittaiseksi transkriptioksi. Jos tryptofaania kuitenkin esiintyy, ribosomi pysyy liikkeessä ja estää sekä hiusneulan 1/2 että 2/3 muodostumisen (Kuva. 2c). Vaimennin hiusneula 3/4 voi muodostaa ja lopettaa transkription. Tämän jälkeen leader-peptidi ja lyhyt leader-RNA hajoavat nopeasti, eivätkä rakennegeenit transkriboidu. Tarkista mekanismi ja ratkaise seuraava testi.
tässä kuvitteellisessa kokeessa käytetään kahta trp-operonimutanttia: toisessa tryptofaania koodaavat UGG-kodonit muunnettiin GGGs-kodoneiksi (glysiinin kodonit, nimetty ”trp-kodonimutantiksi” koko testin ajan); toisessa poistettiin Alue 3 (”Alue 3-mutantti”).
villityypin E. coli-soluja, ”trp-kodonimutantteja” ja ”region 3-mutantteja” viljellään runsaassa väliaineessa, joka sisältää kaikki aminohapot (mukaan lukien tryptofaani) optimaalisina pitoisuuksina. Mitä heille tapahtuu?
Koeanalyysi
- (a)
, Jos annettu tieto tukee väitettä;
- (b)
, Jos lausunto on ristiriidassa annetun tiedon kanssa;
- (c)
, jos annettu tieto ei tue tai ole ristiriidassa väittämän kanssa.
- 1)
____ ”Trp-kodonimutantin” solut kuolevat.
- 2)
___ villityypin solut kasvavat nopeimmin.
- 3)
____ ”alueen 3 mutanttisolut” kasvavat hitaimmin tällaisissa olosuhteissa.
- 4)
____ kromosomi–polysome-komplekseja muodostuu trp-operoniin kaikissa kolmessa solussa.
- 5)
____ tryptofaania syntetisoidaan merkittäviä määriä vain ”alueen 3 mutanttisoluissa”.
- 6)
____ käyttäen TRP Leaderin DNA‐fragmenttia luotaimena Pohjoinen blot-analyysi solurna: sta ”trp kodonimutanteissa” tunnistaa vahvan kaistan, joka vastaa 140-nukleotidi-RNA: ta.
- 7)
____ saman luotaimen avulla havaitaan villin tyypin solun RNA‐näytteistä suuria määriä täyspitkiä trp‐operonitranskriptejä.
samoja soluja kasvatetaan nykyään väliaineessa, joka sisältää kaikki aminohapot tryptofaania lukuun ottamatta. Miten solut käyttäytyvät tällaisissa olosuhteissa?
Koeanalyysi
- (a)
, Jos väitettä tukevat annetut tiedot;
- (b)
, jos väitettä vastaan on ristiriitaa annetut tiedot;
- (c)
, jos väitettä ei tue eikä ole ristiriidassa annettujen tietojen kanssa.
- 8)
____ ”Trp-kodonimutantin” solut kuolevat.
- 9)
___ villityypin solut kasvavat nopeimmin.
- 10)
____ ”alueen 3 mutanttisolut” kasvavat hitaimmin tällaisissa olosuhteissa.
- 11)
____ kromosomi–polysome-komplekseja muodostuu trp-operoniin kaikissa kolmessa solussa.
- 12)
____ tryptofaania syntetisoidaan merkittäviä määriä vain ”alueen 3 mutanttisoluissa”.
- 13)
____ käyttäen TRP Leaderin DNA‐fragmenttia luotaimena Pohjoinen blot-analyysi solurna: sta ”trp kodonimutanteissa” tunnistaa vahvan kaistan, joka vastaa 140-nukleotidi-RNA: ta.
- 14)
____ saman luotaimen avulla havaitaan villin tyypin solun RNA‐näytteistä suuria määriä täyspitkiä trp‐operonitranskriptejä.