Hyperpolarisaation aiheuttama AD fasilitaatio
me ensin mittasimme presynaptisen solun lyhyen hyperpolarisaation esiintyvyyden synaptisessa transmissiossa. Rotan hippokampuksen organotyyppiviljelmissä havaittiin monosynaptisesti yhdistettyjä CA3-hermosolupareja 8-10 päivän in vitro (Div)jälkeen 21. Ennen presynaptista piikkiä toimitetun 200 ms: n hyperpolarisoivan esipulssin havaittiin lisäävän synaptista lujuutta ∼20% (Kuva. 1 A). Tämä lisäys havaittiin mitattaessa joko amplitudia tai varausta postsynaptisesta vasteesta (Supplementary Fig. 1). Näissä kokeissa presynaptinen lepopotentiaali oli -74±3 mV (n=10). H-ADF oli vertailukelpoinen, kun presynaptinen hyperpolarisaatio oli -84 tai -102 mV (vastaavasti 124±8% vs. 119±5%, n=10; Wilcoxonin testi p>0.1), mikä viittaa siihen, että presynaptinen hyperpolarisaatio ∼10 mV riittää tyydyttyvän h-ADF: n saamiseen. h-ADF: ään liittyi pienentynyt paripulssisuhde (PPR, 99±7-88±5%, n=12; Wilcoxonin testi p<0, 05; täydentävä Kuva. 1), mikä viittaa siihen, että se johtuu glutamaatin vapautumisen presynaptisesta lisääntymisestä.
(a) synaptisen lähetyksen helpottaminen CA3–CA3-yhteyksissä hyperpolarisoivalla Pre-pulssilla (kesto 200 ms). Vasemmalla äänityskokoonpanon kaavio. Keskimmäinen esimerkki presynaptisen hyperpolarisoivan pulssin tuottamasta fasilitaatiosta (10 jälkeä laskettiin keskimäärin). Tiivistelmä preynaptisesta hyperpolarisaatiosta, joka lisää amplitudia. Huomaa, että mitään muita helpotuksia ei aiheutunut, kun hyperpolarisoivan esipulssin suuruutta lisättiin. (b) h-ADF voidaan indusoida lyhyellä presynaptisella hyperpolarisaatiolla. Vasemmalla, esimerkkejä tallennus pari kytketty CA3 pyramidin neuronien ilman hyperpolarisaatio ja 15, 50, 100 ja 200 ms hyperpolarisaatio -93 mV ennen piikki. Oikein, Yhteenveto 15, 50, 100 ja 200 ms: n aiheuttamasta fasilitaatiosta (kaikki Wilcoxonin testi, p<0, 05, n=7). c) d – ja H-ADF ilmaistaan coexpressed at CA3–CA3 yhteydet. Vasen, edustava esimerkki. Huippujäljet, presynaptisen neuronin kalvopotentiaali kontrollissa (musta), aikana d-ADF (punainen), aikana H-ADF (sininen) ja kun d – ja H-ADF yhdistetään (Tummanpunainen). Pohjajäljet, postsynaptiset vasteet kussakin tapauksessa olivat keskimäärin yli 10 koetta. Aivan, ryhmätiedot (Mann-Whitney-testi, n=16, d-ADF, 11, h-ADF ja 16, D – ja H-ADF). Huomaa vaihteiston asteittainen kasvu, kun D-ja H-ADF yhdistetään.
200 ms: n pituinen hyperpolarisaatio ei todennäköisesti tapahdu fysiologisessa yhteydessä. Siksi tutkimme h-ADF: n ajankulkua lyhyemmillä hyperpolarisaatioilla (15, 50, 100 ja 200 ms). h-ADF havaittiin kaikilla testatuilla hyperpolarisaation kestoilla (15 ms: 111±3%, 50 ms: 116±4%, 100 ms: 109±4%, 200 ms: 120±6% Wilcoxon, p<0, 05 kaikille kestoille, N=7, Kuva. 1b). Tämän tuloksen mukaan h-ADF on todennäköisesti aiheutunut fysiologisesta hyperpolarisaatiosta.
CA3 pyramidin neuronit ilmaisevat depolarisaation aiheuttamaa AD-fasilitaatiota (d-ADF), joka johtuu Kv1.1-kanavien hitaasta inaktivoitumisesta (aikavakio: 3.3 s)13. Näin tutkimme, ilmaistiinko sekä d – että H-ADF samoissa CA3–CA3-yhteyksissä. Presynaptiset APs: t laukesivat vaihtoehtoisesti lepokalvon potentiaalista (-78 mV-kontrolli), pitkän alikynnyksen depolarisaation (10 s, -62.6 mV, d-ADF) jälkeen, lyhyen hyperpolarisaation (200 ms, -96.1 mV, h – ADF) jälkeen tai pitkän depolarisaation ja lyhyen hyperpolarisaation (d-ja h-ADF; Fig. 1C, vas.). Itse asiassa kahden ADF-muodon yhdistelmä tuotti samoissa yhteyksissä suuremman helpotuksen (113±3%, n=16; Kuva. 1c) kuin kunkin protokollan erikseen tuottama (d-ADF yksin: 105±3%, n=16, h-ADF yksin: 108±4%, n=11; Kuva. 1c). Keskimääräisten h-ja d-ADF-lukujen havaittiin laskevan yhteen lineaarisesti, mikä viittaa kahteen itsenäiseen molekyylimekanismiin. Lisäksi samoissa pareissa mitatut d-ja H-ADF korreloivat positiivisesti (Supplementary Fig. 1), mikä viittaa siihen, että jotkin synaptiset yhteydet ovat herkempiä AD-fasilitaatiolle, luultavasti siksi, että analogisen signaalin eteneminen aksonia pitkin riippuu Soman ja presynaptisten päätteiden välisestä etäisyydestä. Nämä tiedot osoittavat, että H-ja d-ADF elävät rinnakkain CA3 pyramidimaisissa neuroneissa ja että taustalla olevat mekanismit ovat todennäköisesti riippumattomia.
h-ADF: ää havaittiin nuorilla CA3–hermosoluilla (P5–P7-rotista valmistettu DIV8-10), joten se saattoi johtua lähinnä jännitegeneroitujen ionikanavien vähäisestä tiheydestä tai epäkypsistä ominaisuuksista. Siksi selvitimme, löytyikö h-ADF: ää myös kypsistä CA3-pyramidisoluista. Kytkettyjen CA3-neuronien paritallenteet saatiin DIV24-DIV32-viipaleviljelmissä. Lyhyt presynaptinen hyperpolarisaatio (200 ms) lisäsi merkittävästi synaptista vahvuutta (104.2±1, 1% n=25; Wilcoxon, p<0, 01; täydentävä Kuva. 2). kypsistä soluista mitattu H–ADF oli pienempi kuin kehittyvillä neuroneilla mitattu (Mann-Whitney, p<0,01; Supplementary Fig. 2). Näin ollen voimme päätellä, että h-ADF: ää kehitetään CA3-hermosoluissa in vitro.
kaikki tallenteet saatiin suurella solunulkoisella kalsiumpitoisuudella (3 mM) synaptisen lujuuden optimoimiseksi. Näissä olosuhteissa presynaptinen vapautumistodennäköisyys on suuri ja presynaptinen fasilitaatio, kuten h-ADF, voidaan aliarvioida. Siksi mittasimme h–ADF: n kypsistä CA3-neuroneista (DIV24-DIV32), jotka on kirjattu fysiologisella solunulkoisella kalsiumilla (1,3 mM)22. Näissä olosuhteissa h-ADF: n todettiin olevan noin +16,4% (Wilcoxon, p<0,01; täydentävä Kuva. 2). Johtopäätöksemme on, että H-ADF on voimakkaasti ilmaistu kypsissä neuroneissa, jotka on kirjattu fysiologiseen solunulkoiseen kalsiumiin.
h-ADF indusoidaan simuloiduilla Ipsp: llä ja heilahduksilla
h-ADF: n roolin tutkimiseksi lähes fysiologisissa olosuhteissa presynaptisessa hermosolussa otettiin käyttöön Gabaa-tyyppinen konduktanssi dynaamisen puristimen avulla (kuva. 2A, vas.). Yhtäpitävästi kuvaamien tulosten kanssa. 1, APs, jota edelsi IPSC: n kaltaisen virran ruiskutus, tuotti postsynaptisessa hermosolussa suuremman vasteen kuin Lepokalvon potentiaalista laukaistu APs (Wilcoxon p<0, 001, n=11). Glutamaatin vapautumisen presynaptisen nousun vuoksi PPR-arvo pieneni, kun simuloidut Gabaergiset Ipsp: t edelsivät APs: ää (kontrolliryhmän 121%: sta 96%: iin; Wilcoxonin p<0, 05, n=7; Tietoja ei näy). Mielenkiintoista on, että synapsisen potentiaation koon havaittiin riippuvan simuloidun IPSP: n koosta (R2=0, 39, p<0, 05), mikä viittaa siihen, että h-ADF luokitellaan lepokalvopotentiaalin (-74 mV) ja 10-mV: n hyperpolarisaation (-84 MV; Fig. 2A, oik.). Itse asiassa tämän alueen fasilitaatiokertoimeksi todettiin 1,8% hyperpolarisaation mV: ssä.
(a) Presynaptiset Ipsp: t indusoivat h-ADF: ää. Vasemmalla on kaavamainen esitys järjestelmästä, jolla ruiskutetaan gabaergistä virtaa presynaptiseen hermosoluun. Keskellä esimerkkejä elektrofysiologisista tallenteista kytketystä CA3-hermosoluparista kontrolliolosuhteissa (mustat jäljet) ja kun simuloitu GABAerginen tulo ruiskutetaan presynaptiseen soluun (siniset jäljet). Oikein, hajontakaavio, joka näyttää normalisoidun EPSP / C: n simuloidun presynaptisen IPSP: n huippuarvon funktiona. Havaittiin selvä lineaarinen korrelaatio (y=-1, 8 x+101, 8, Pearsonin R2=0, 39, p<0, 05, n=11). (b) h-ADF indusoituu aliresurssin θ oskillaation aikana CA3-neuroneissa. Vasen, edustava esimerkki. Presynaptiset piikit käynnistyvät eri vaiheissa kalvopotentiaalin alikynnyksen värähtelyn aikana 4 Hz: n taajuudella. Huomaa, että fasilitaatiota havaitaan, kun piikki aktivoituu värähtelyn hyperpolarisoituneiden vaiheiden aikana. Oikea, määrälliset tiedot (n=8). Tähdet: merkittävät muutokset (Wilcoxon, p<0,05).
seuraavaksi tutkittiin synaptisen voimakkuuden modulaatiota presynaptisen kalvopotentiaalioskillaation aikana. Presynaptisen kalvopotentiaalin värähtely 4 Hz: n taajuudella saatiin aikaan sinimuotoista virtaa ruiskuttamalla, ja yksittäiset presynaptiset piikit saatiin aikaan värähtelyn eri vaiheissa. Aiempien tulosten mukaisesti h-ADF havaittiin solun laukaistessa värähtelyn hyperpolarisointivaiheiden aikana (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon p<0,05, n=8; Kuva. 2b). Muissa faaseissa synaptinen lujuus ei muutu (56 ms: 112, 2±6%, 163 ms: 95, 8±5%, 211 ms: 110, 5±6%, Wilcoxon p>0, 1, n=8). Erityisesti D-ADF: ää ei havaita depolarisaatiolla, koska sen kesto on liian lyhyt KV1.1-kanavoiden13 inaktivoimiseksi. Päädymme siihen, että θ-alueen heilahtelut indusoivat CA3-hermosoluissa h-ADF: ää.
h-ADF liittyy aksonaalisen piikin amplitudin nousuun
seuraavaksi selvitimme h-ADF: n taustalla olevia mekanismeja. Mahdollinen mekanismi h-ADF: lle on hyperpolarisaation indusoiman presynaptisen piikin amplitudin modulaatio. Siksi tutkimme hyperpolarisaation seurausta aksonissa mitatusta piikin amplitudista. CA3-neuronit täytettiin Alexa 488: lla (50 µM) aksoniarborisaation visualisoimiseksi, ja aksonista saatiin soluun liitettyjä tallenteita 60-240 µm: n etäisyyksillä (Kuva. 3 A). Somaattisessa hyperpolarisaatiossa aksonaalisen piikin Amplitudi parani (106±1% kontrollin amplitudista, n=6, Wilcoxon, P<0,05; Kuva. 3b). Aksonaalisen piikin fasilitaation magnitudin havaittiin kuitenkin pienenevän aksonaalisen etäisyyden ollessa 212 µm (Kuva. 3b). Johtopäätöksenä voidaan todeta, että CA3-neuronien h-ADF liittyy paikalliseen piikkiamplitudin kasvuun aksonissa.
(a) vasen, konfokaalinen kuva Ca3-hermosolusta, joka on täytetty Alexa 488: lla. Aksonivakuus (valkoinen nuoli) tunnistetaan vasemmalla ja kirjataan soluun liitetyssä kokoonpanossa. Oikea, yhtäaikaisia tallenteita soma (ylhäältä) ja aksoni (alhaalta), kun piikki laukeaa lepokalvopotentiaalista (musta) tai ohimenevästä hyperpolarisoivasta pre-pulssista (sininen). (B) vasemmalla, vertailu piikki Amplitudi mitattu aksoni esitetty (sininen) tai ilman (musta) hyperpolarisoiva pre-pulssi. Huomaa amplitudin kasvu aksonissa, kun piikki laukaistaan hyperpolarisoivasta esipulssista. Keskimmäinen kvantitatiivinen analyysi hyperpolarisaation aiheuttamasta aksonaalisen piikin amplitudin lisäyksestä kuudessa neuronissa. Oikein, aksonaalisen piikin amplitudin muutoksen hajontakäyrä aksonaalisen etäisyyden funktiona (eksponentiaalinen sovitus, y=11.6 e−x / 212, r2=0.81).
vaikka kokosolujen kirjaaminen CA3-aksoneista on erittäin vaikeaa organotyyppiviljelmissä, se voidaan saada L5 pyramidimaisista neuroneista akuuteista viipaleista 5,6. Siksi mittasimme ensin, voitaisiinko h-ADF havaita myös L5-L5-eksitatorisissa yhteyksissä. Nuorten rottien sensori-motorisesta aivokuoresta (P14–P20) kirjattiin akuutteina viipaleina yksikytkentäisiä L5 pyramidin hermosoluja. Presynaptisen neuronin Soman (200 ms, 10-15 mV) lyhyen hyperpolarisaation havaittiin lisäävän synaptista voimaa (109, 6±2, 3%, n=13, Wilcoxonin testi, p<0, 05; Kuva. 4 A).
(a) Synaptisesti kytkettyjen L5 pyramidin neuronien Paritallennus. Keskimmäinen, synaptinen fasilitaatio, joka saadaan aikaan lyhyellä presynaptisella hyperpolarisaatiolla (-20 MV; 200 ms). EPSCs vastaa 25 traces-järjestelmän keskiarvoja. Aivan, h-ADF saatu 12 L5-L5 paria. (b) Dual soma–aksoni tallenteet L5 pyramidin neuronien. Vasemmalla koesuunnittelu, jossa näkyy kaksoisnauhoitus pyramidin L5-hermosolun somasta ja aksonaalisesta blebistä. Keskimmäinen Soma-aksoni tallentuu pyramidin L5-hermosoluihin. Huomaa, että Soman lyhyt hyperpolarisaatio parantaa piikin amplitudia aksonissa, mutta ei somassa. Oikealla ylhäällä AP-ylitys mitattuna aksonista solurungon kalvopotentiaalin funktiona lepäävissä (mustissa) tai hyperpolarisoiduissa (sinisissä) potentiaaleissa (N=6 jälkeä kussakin tapauksessa). Oikea alaosa, vaihe juoni aksonaalinen piikkejä herättivät levossa (musta) ja sen jälkeen lyhyt hyperpolarisaatio (sininen). Huomaa parannettu Amplitudi lyhyen hyperpolarisaation jälkeen (nuoli). Myös depolarisaation nopeus tehostuu ja piikin kynnys on hieman hyperpolarisoitunut.
sen varmistamiseksi, että H-ADF L5 pyramidin neuroneissa liittyi aksonipiikin amplitudin kasvuun, saatiin samanaikaisesti kokosolun tallenteita soma-ja cut-end-aksoneista (blebs) (50-80 µm soma: sta) L5 pyramidin neuroneissa. Soma: n ohimenevä hyperpolarisaatio (noin -13 mV) paransi piikin ylityksen amplitudia aksonissa mutta ei soma: ssa (+5, 5±1, 5 vs. -0, 3±1, 1 mV, n=5, Mann–Whitney, p<0, 05; Kuva. 4b). Myös depolarisaation nopeutta lisättiin (251±59-289±56 MV ms−1, n=5) ja piikkikynnys hyperpolarisoitiin (-35,7±5,2–38,8±4,3 MV, n=5). Voimme päätellä, että H-ADF sekä CA3 ja L5 pyramidin solujen liittyy kasvua piikki Amplitudi mitattu aksoni.
h-ADF liittyy aksonaalisten kalsiumsignaalien paranemiseen
seuraavaksi määritimme Ca2+-kuvantamisen avulla hyperpolarisaation aiheuttaman piikkiamplitudin lisääntymisen seurauksen aksonissa. CA3 pyramidin neuronien täytettiin 50µm Alexa-594; 250 µM Fluo-4 ja piikki-herättämä kalsium signaalit mitattiin oletettu en passant boutons etäisyyksillä vaihtelevat 150 ja 250 µm päässä soma (Kuva. 5 a). Piikin herättämän Ca2+ transientin integraali kasvoi, kun presynaptinen piikki herätettiin ohimenevän hyperpolarisaation (∼20 MV) (126±10%, n=5; Kuva. 5b). Päätämme, että H-ADF: n aikana presynaptinen hyperpolarisaatio parantaa sekä presynaptista piikin amplitudia että piikin aiheuttamaa Ca2+-virtaa, mikä myöhemmin parantaa glutamaatin vapautumista.
(a) lyhyt hyperpolarisoiva Pre-pulssi voimistaa piikin aiheuttamaa Ca2+-ohimenevää ilmiötä. Vasemmassa yläosassa kokeellinen kuvio, jossa näkyy CA3 pyramidin muotoinen neuroni, joka on täynnä Alexa-594: ää ja Fluo-4: ää. Valkoinen laatikko: alue suurennettu oikealla, näkyy presynaptinen bouton. Oikealla ylhäällä, jännitejälkiä CA3 pyramidin solurungossa. Oikea alaosa, esimerkki loisteputkisignaaleista, jotka on tallennettu presynaptiseen boutoniin. Piikin aiheuttama Ca2+ ohimenevä suureni ∼20%, kun presynaptinen piikki havaittiin ohimenevän hyperpolarisaation seurauksena. (B) kvantitatiiviset tiedot (N=5).
Navikanavan inaktivaatio aksonissa määrittää h-ADF
aksonipiikin lisääntynyt Amplitudi hyperpolarisaation aikana voi johtua Navikanavien palautumisesta inaktivaatiosta. Vahvistaaksemme natriumkanavan inaktivaation roolin h-ADF: ssä, käytimme kahden monosynaptisesti kytketyn CA3-neuronin NEURONIMALLIA. Sitten määritimme natriumkanavien inaktivaation muuttumisen h-ADF: n aksonissa. Kun aksonaalisten natriumkanavien puoli-inaktivaatio asetettiin arvoon -80 mV (viite 18, 19), somaattinen hyperpolarisaatio paransi piikin amplitudia, piikin herättämän kalsiumvirran varausta ja synaptista transmissiota (Kuva. 6A, vas.). Tämä johtuu Navikanavien palautumisesta inaktivaatiosta hyperpolarisaation avulla (kuva. 6B, vas.). Muutosta ei kuitenkaan tapahtunut, jos aksonaalisten natriumkanavien puolinaktivaatio asetettiin arvoon -70 mV (Kuva. 6A, oik.). Tässä jälkimmäisessä tapauksessa, osuus käytettävissä Nav kanavat on jo erittäin korkea lepokalvon potentiaali, tuottaa AP täyden amplitudin (Kuva. 6a, B, oik.). Siksi inaktivaatiosta palautuminen ei vaikuta presynaptiseen piikin amplitudiin. Näin ollen mallin h-ADF johtuu Navikanavien palautumisesta inaktivaatiosta ja sitä lisätään hyperpolarisoimalla Nav puoli-inaktivaatio (Kuva. 6c).
(a) simuloitu h-ADF kontrolliolosuhteissa (V1 / 2 inaktivaatio=-80 mV aksonaalisille natriumkanaville). Huomaa piikin lisääntynyt Amplitudi. H-ADF: n puuttuminen, kun aksonaalisen natriumkanavan puoli-inaktivaatio depolarisoituu (V1/2=-70 mV). (B) Yhteenveto navaxonin saatavuudesta V1/2 inaktivaatiolla=-80 MV tai -70 mV. Huomattava lisäys on -80 mutta ei -70 mV. C) simuloidun H-ADF: n suuruus aksonin Navikanavien V1/2 inaktivoinnin funktiona. Huomaa V1/2: n hyperpolarisaation aiheuttama h-ADF: n lisääntyminen. d) kokeellinen Nav-inaktivaation tehostaminen CBZ: llä lisää h-ADF: n suuruutta. Ohjausolosuhteissa (vasemmalla) tämä yhteys ei ilmaise h-ADF: ää. Kun CBZ lisätään, h-ADF on nyt näkyvissä (oikealla). (e) kvantitatiiviset tiedot 10 kypsästä CA3–CA3-yhteydestä (kaksinumerotaso 24-32). Tähti: Wilcoxon, P<0,05.
lisäksi käytimme neuronimalliamme simuloimaan aksonaalisen Navikanavan käytettävyyttä Theta-värähtelyn aikana, joka oli samanlainen kuin Fig: ssä. 2 B. Nav-kanavien havaittiin inaktivoituvan depolarisaation aikana ja palautuvan hyperpolarisaation aikana, mikä selittää epsc-modulaation oskillaation aikana (täydentävä Kuva. 4). Inaktivaatio on kuitenkin nopeampaa kuin palautuminen oskillaation aikana, koska Nav-kinetiikka on hitaampaa depolarisoiduissa potentiaaleissa (täydentävä Kuva. 4). Tämä selittää, miksi 163 ms: n teholla valmistetuissa Epsc: issä ei esiintynyt h-ADF: ää, vaikka piikki on peräisin hieman hyperpolarisoidusta potentiaalista (Kuva. 2b). Itse asiassa tässä vaiheessa oskillaatio Nav kanavat ei ollut tarpeeksi aikaa toipua inaktivointi (täydentävä Kuva. 4).
kokonaisuudessaan nämä tulokset tukevat sitä, että H-ADF johtuu Navikanavien palautumisesta inaktivaatiosta.
Nav-kanavan tiheys määrittää h-ADF: n vahvuuden
h-ADF riippuu natriumkanavien saatavuudesta aksonissa. Näin ollen Navikanavien tiheyden vähentäminen vaikuttanee h-ADF: ään. Itse asiassa mallimme osoitti, että Nav-kanavan tiheyden vähentäminen 70%: iin ohjausolosuhteista paransi h-ADF: ää 130: stä 180%: iin (Kuva. 7 a). Kriittinen parametri tässä oli voitto presynaptinen piikki ylitys, joka riippuu aktivoituva Na konduktanssi (Kuva. 7b). Kontrollitilassa tämä arvo oli jo korkea, ja presynaptisen elementin hyperpolarisointi -78: sta -93 mV: iin paransi piikin amplitudia 28%. Kun Nav: n tiheyttä pienennettiin, sama hyperpolarisaatio paransi presynaptisen AP: n amplitudia 42%.
(a) Navikanavatiheyden vähentäminen h-ADF: n mallissa. Kontrolliolosuhteissa (vasemmalla) h-ADF on +30 prosenttia. Kun Nav – kanavan tiheyttä on vähennetty (70% ohjauksesta, oikea), h-ADF nostetaan + 80%: iin. (b) presynaptisen piikin amplitudin modulaatio aktivoituvan na-konduktanssin funktiona. Kontrolliolosuhteissa hyperpolarisaatio -78: sta -93 mV: hen nostaa vain hieman piikin amplitudia (musta kaksoisnuoli). Kun Navikanavan tiheys pienenee, piikin amplitudin kasvu paranee 20% (Vaaleansininen kaksoisnuoli). C) kokeellinen Nav-tiheyden vähentäminen TTX: llä. Ohjausolosuhteissa (vasemmalla) tämä yhteys ei ilmaise h-ADF: ää. Kun TTX: ää lisätään pieni pitoisuus, transmissio säilyy ja H-ADF on nyt näkyvissä (oikealla). (d) kvantitatiiviset tiedot kuudesta kypsästä CA3–CA3-yhteydestä (kaksinumerotaso 20-32). Tähti: Wilcoxon, P<0,05.
seuraavaksi varmistimme kokeellisesti, että Navikanavan tiheyden pienentäminen lisäsi h-ADF: ää CA3-neuroneissa. Siksi estimme osittain Nav-kanavat, joissa on alhainen tetrodotoksiinipitoisuus (TTX) kylvyssä (15-25 nM). Tällä pitoisuudella TTX estää ∼80% Na + – virrasta, mutta säilyttää nopeiden Na+ – piikkien induktion24, 25. TTX: n läsnä ollessa piikin Amplitudi soma: ssa pieneni 45±4% (n=9) ja synaptinen transmissio CA3–CA3-liitoksissa pieneni 55±8% (n=9; täydentävä Kuva. 5). Mikä tärkeintä, aktivoituvien Nav-kanavien osuuden pienentämisen 15-25 nM TTX: llä havaittiin parantavan suuresti h-ADF: ää kypsissä neuroneissa, jotka eivät ilmaise h-ADF: ää (kontrollissa 103±3%: sta 121±4%: iin TTX: n läsnä ollessa, N=6, Wilcoxon p<0, 05; Fig. 7 c, d). Nämä tiedot siis vahvistavat, että CA3-neuronien h-ADF riippuu Nav-kanavien saatavuudesta.
T-tyypin Ca2+ – kanavia on aksonissa. Ne voivat aktivoitua hyperpolarisaatio-depolarisaatiosekvenssin aikana, jota käytetään h-ADF: n indusoimiseen, ja siten ne voivat selittää h-ADF: n. H-ADF: n havaittiin kuitenkin pysyvän stabiilina käytettäessä 100 nM: n mibefradiilia, T-tyypin kanavasalpaajaa (kontrolliryhmässä 112, 2±1, 1%: sta 116, 2±11, 9%: iin mibefradiililla, n=3; tietoja ei näy), mikä viittaa siihen, että T-tyypin Ca2+ – kanavat eivät osallistu h-ADF: ään.
h-ADF edistää verkon synkroniaa
seuraavaksi testasimme h-ADF: n implisiittisyyttä verkon synkroniassa hippokampaalisella verkostomallilla, joka muodostuu 80 pyramidin kaltaisesta eksitatorisesta solusta (e-soluista) ja 20 interneuronin kaltaisesta inhibitorisesta solusta (i-soluista), jotka ovat yhteydessä toisiinsa (Kuva. 8a; KS. menetelmät). e-ja i-soluja ruokittiin stokastisella syötöllä. E-solujen verkosto synkronoitui, ja värähtelyt gamma-alueella ilmaantuivat e-solujen välisen synaptisen lujuuden kasvaessa (Supplementary Fig. 6). Näitä heilahduksia ajoivat i-solut: e-solujen aktivaation havaittiin edistävän i-solujen aktivoitumista, mikä puolestaan hiljensi koko verkoston (täydentävä Kuva. 6). Koska h-ADF lisää interpyramidaalisen synaptisen vahvuuden, kun presynaptista piikkiä edeltää IPSP, h-ADF on hyvä ehdokas edistämään näitä I-solulähtöisiä värähtelyjä.
(a) Ca3-verkkomallin järjestelmä. Verkko koostuu 80 e-solusta (valkoiset kolmiot) ja 20 i-solusta (punaiset ympyrät). Pyramidisoluja ja interneuroneja syötettiin stokastisella syötöllä. Pyramidisten neuronien väliset yhteydet (siniset nuolet) ovat ainoat yhteydet, joihin h-ADF voidaan lisätä, koska h-ADF: ää ei testattu kokeellisesti muissa yhteyksissä. (b) h-ADF sääntö excitatory synapses välillä pyramidaalinen neuronien. Maksimissaan 20%: n fasilitointi tehdään kalvojännitteen mukaan, joka on mitattu 17 ms ennen piikkiä. c) h-ADF-säännön vaikutus verkkosynkroniaan. Vasemmalla ylhäällä rastergram, jossa näkyy verkon aktiivisuus kontrolliolosuhteissa synaptisella vahvuudella 2,8 mS. vasemmalla alhaalla, edustava jälki e-solussa. Oikealla ylhäällä, h-ADF-säännöllä (+20% h-ADF), synkroniaa lisätään. Oikea alaosa, jäljitys e-solussa. Huomaa, että kalvo potentiaali ylittää −73-mV raja välillä piikkejä (katkoviivoja). (d) kohdassa c esitettyjen tietojen tehospektri (synaptinen voimakkuus 2,8 mS). H-ADF-sääntöjen lisääminen lisää merkittävästi verkon synkroniaa gammataajuuden (29 Hz) ympärillä. (e) Synaptisille vahvuuksille lasketut Synkronointikertoimet 2: sta 3.6: een. H-ADF: n sisällyttäminen lisää synkroniaa (sininen).
h-ADF-sääntö sisällytettiin verkkoon lisäämällä e-solujen välistä synaptista lujuutta sen mukaan, mikä kalvopotentiaali mitattiin 17 ms ennen piikkiä. Itse asiassa synaptinen vahvuus kasvoi 20%, jos presynaptinen potentiaali oli alle -84 mV (Kuva. 8b). Tämä sääntö johdettiin suoraan kokeellisesti mitatuista arvoista (KS.viikunat 1a ja 2a). Kun e-solu-synaptinen vahvuus oli 2,8 mS, H-ADF: n lisääminen verkkoon paransi merkittävästi sekä laukaisutaajuutta että synkroniaa e-solujen välillä (Kuva. 8c-e). Itse asiassa Gamma-alueen värähtelyalttius helpottui huomattavasti, jos e-solujen välinen H-ADF oli tehokas (Fig. 8 e). Mielenkiintoista on, että verkko, jossa vaihtotyö esto (ECl=-73 MV sijaan -80 mV ohjaus kunnossa), h-ADF-sääntö ei parantanut synkroniaa eikä edistänyt gamma värähtelyä (täydentävä Kuva. 6). Koska h-ADF kuitenkin lisää synaptista voimaa e-solujen välillä, sen synkronoiva vaikutus voi johtua yksinkertaisesti verkon piikkinopeuden kasvusta. Jotta piikkinopeus kasvaisi vaikuttamatta synaptiseen lujuuteen, päätimme korjata e-solujen välisen lujuuden 2,5 mS: iin ja lisätä E-solujen ulkoista taajuusaluetta 6 Hz: stä 20 Hz: iin. Piirrimme synkronointikertoimen ja verkon piikin. Vaikka synchrony osoitti lineaarisesti korreloi piikki korko, h-ADF lisäsi synkronoinnin kerroin tahansa piikki nopeudella 4-14-Hz alueella (täydentävä Kuva. 6). Tämä osoitti, että alhaisen piikin aikana h-ADF lisää synkroniaa riippumatta verkon keskimääräisestä aktiivisuudesta. Yhteenvetona voidaan todeta, että mallissamme h-ADF lisää verkon synkronointia ja edistää värähtelyjä yhdistämällä interpyramidaalisen synaptisen voiman interneuronien aktiivisuuteen.