eliminoimiseksi kohdennettujen kotiutettavien endonukleaasien tehon valjastamiseksi Jeromen laboratorio pyrki optimoimaan hyödyllisen annostelujärjestelmän sekä in vivo-että in vitro-tutkimuksissa. He käyttivät adeno-associated virus (AAV) – annostelujärjestelmää kohdentaakseen hiiren kolmoisganglioita joko kahdella HSV-spesifisellä endonukleaasilla: HSV1m5, joka on suunniteltu irrottamaan virion-proteiinin VP5-geeni, ja HS1m8 ,joka kohdistuu DNA-polymeraasin katalyyttistä alayksikköä koodaavaan geeniin. Mutaatioiden luominen jompaankumpaan näistä geeneistä aiheuttaa viruksen perimän häiriöitä ja estää virionin tuotannon. Trex-2-hoidon vaikutusten lisäämiseksi käytettiin samanaikaisesti 3′-5′ – endonukleaasia, jonka on osoitettu lisäävän suunnattua mutageneesiä. Järjestelmän perustamisen jälkeen laboratorio aloitti in vitro-työn keskittyen neuroneihin, biologisesti relevanttiin solutyyppiin. Hermosoluviljelmät transdukoitiin HSV1m5: llä tai 8: lla ja Trex-2: lla, minkä jälkeen ne infektoitiin HSV: llä. Hoidetuissa viljelmissä virustitteri aleni 50% ja HSV: ssä havaittiin mutaatioita T7-Endonukleaasi 1-määrityksessä ja kloonisessa sekvensoinnissa. Kun lystinen infektio todettiin, tutkijat alkoivat tarkastella vaikutuksia HSV-infektion eri vaiheisiin. Käyttämällä infektoituneita hermosoluviljelmiä HSV: llä ja myöhemmin hsv1m5: llä tai 8: lla Trex-2: lla hoidettuja eri ajankohtina tutkijat voisivat simuloida infektion eri vaiheita. He käsittelivät viljelmiä 7 päivän (akuutti vaihe), 14 päivän (akuutti myöhäinen/ varhainen latentti vaihe) ja 32 Päivän (latentti vaihe) kuluttua eivätkä havainneet tehomuutosta virusvaiheesta riippumatta. Tämä viittaa siihen, että HSV on samalla tavoin altis endonukleaasi-mutageneesille virusvaiheesta riippumatta. Kohdemutaatioiden tasot olivat HSV1m5: llä 4, 5-7, 6% ja HSV1m8: lla 1, 1-6, 6%. Tällä hetkellä kyseessä on ensimmäinen tutkimus, jossa tarkastellaan endonukleaasin aktiivisuutta piilevästi infektoituneissa neuroneissa.
in vitro-tulosten rohkaisemana tutkijat tekivät in vivo-tutkimuksia HSV-tartunnan saaneilla hiirillä, joita seurasi 32 päivää myöhemmin Aav-injektio (ilmentäen HSV1m5 tai 8 ja Trex-2). Hiirten neuroneista otettiin 30 päivää Aav-injektion jälkeen näyte virustitterin, viruskuorman ja HSV: n genomimutaatioiden varalta. Ryhmässä oli 1-2% mutaatioita 2/4 hiirellä HSV1m5: llä ja 3/4 hiirellä HSV1m8: lla. Näiden eläinten viruskuorma oli kuitenkin sama kontrolliryhmän ja hoidettujen eläinten välillä. Viruksen irtoaminen viivästyi yhdellä päivällä hoitoa saaneilla eläimillä, mutta määrä oli ajan mittaan samansuuruinen kuin hoitamattomilla eläimillä. Pohdittuaan tuloksia Tri Jerome sanoi, ” Tämä on ensimmäinen kerta, kun todellinen piilevä virusinfektio on todettu eläimessä, ja sitten käytöstä, jopa osittain, käyttäen endonukleaasi hoito. Se merkitsee siis ratkaisevaa askelta kohti tällaisten hoitomuotojen saattamista ihmisten käyttöön. Suurin haaste on nyt lisätä hoidon tehoa niin, että kaikki tai lähes kaikki piilevä virus on geneettisesti vammainen. Tutkimme uudempia, tehokkaampia nukleaaseja, kuten CRISPR / Cas, ja arvioimme uusia menetelmiä nukleaasien toimittamiseksi infektoituneisiin neuroneihin in vivo.”Tulevaisuudessa tämä hoito voi johtaa uudenlaiseen ajattelutapaan hoitaa piileviä sairauksia, kuten HSV: tä ja HIV: tä, joita pidämme tällä hetkellä parantumattomina.
tutkimuksen rahoittivat National Institutes of Health ja Canadian Foundation.
Aubert M,Madden EA,Loprieno M,DeSilva Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret a,Galleto R,Stone D,Jerome KR. 2016. Piilevän HSV: n häiriintyminen in vivo designer-endonukleaasihoidolla. JCI Insight, 1(14.