1 teoria
Oligonukleotidit syntetisoidaan lisäämällä yksi emäs kerrallaan, joka ulottuu 3′: stä 5′-päähän, kiinnittyneenä kiinteäfaasiseen tukeen. Kun oligonukleotidin kemiallinen synteesi on valmis, DNA-ketju vapautuu kiinteästä kannatimesta inkuboimalla ammoniumhydroksidilla. Ammonium toimii myös deprotektiivisena aineena pilkkoen fosfaatteja suojaavat ryhmät fosfodiesterisidoksissa. Tämän jälkeen lisätään kuumaa ammoniakkia, joka hydrolysoi deoksiadenosiinin, deoksisytosiinin ja deoksiguanosiinin eksosyklisistä aminoryhmistä suojaavia ryhmiä. Oligonukleotidia voitiin toimittaa käyttäjälle ammoniakkiliuoksessa raakavalmisteena. Tässä tapauksessa ennen käyttöä voi olla tarpeen suorittaa lisätoimenpide suojauksen aikana syntyneen oligonukleotidivalmisteen suolojen ja sivutuotteiden poistamiseksi.
deprotektion jälkeen oligonukleotidivalmiste yleensä suolataan, kvantifioidaan, haihdutetaan kuivaksi kylmäkuivaimessa ja toimitetaan käyttäjälle jauheena. Desaltoitu oligonukleotidiliuos sisältää täyspitkän oligonukleotidin, mutta sisältää myös kemiallisen synteesin aikana kertyneiden typistettyjen tuotteiden seosta. Katkaisu tapahtuu, kun määritelty emäs ei lisää ketjua vastaavassa syklissä (Hecker & Rill, 1998). Näin ollen valmisteeseen kertyneiden typistettyjen tuotteiden prosenttiosuus määräytyy synteesitehokkuuden (kokopitkän tuotteen osuus synteesin jälkeen) ja molekyylin pituuden perusteella. Pitkät oligonukleotidit, joiden syntetisoiminen vaatii useampia syklejä, ovat vähemmän puhtaita kuin lyhyet oligonukleotidit. Nämä epäonnistumiset voivat kilpailla täyspitkän tuotteen kanssa joissakin sovelluksissa, ja ne voidaan joutua poistamaan ennen kuin oligonukleotidia voidaan käyttää. Desaltoidut oligonukleotidivalmisteet soveltuvat kuitenkin yleensä moniin sovelluksiin, kuten tavallisiin PCR-tai mikroarmeijoihin, varsinkin jos oligonukleotidi on < 20 nukleotidin pituinen.
suositellaan lisäpuhdistusta yli 50 emästä pitemmille oligonukleotideille, koska täyspitkän tuotteen prosenttiosuus valmisteessa on yleensä enintään 80%. Vaativissa sovelluksissa, joissa oligonukleotidin tarkka pituus on tärkeä, kuten geelisiirtotesteissä, paikkasidonnaisten mutageenien määrityksessä, sekvensoinnissa, kloonaussovittimien tuotannossa tai cDNA-alkujuosteiden synteesissä kirjastojen generointia varten, suositellaan lisäpuhdistusta myös lyhyemmille oligonukleotideille (katso lisätietoja edellä mainituista tekniikoista standardeissa in vitro määrityksissä proteiinin ja nukleiinihapon interaktioita varten-RNA: n ja DNA: n sitoutumisen Geelisiirtotesteissä ja paikkasidonnaisen Mutageneesin määrityksissä).
puhdistus voidaan vaatia synteesin tai oligonukleotidin entsymaattisen muuntamisen jälkeen. Tämän saavuttamiseksi on olemassa useita menetelmiä, ja valinta riippuu oligonukleotidin luonteesta ja sovelluksesta, johon se on tarkoitettu.
Käänteisfaasin HPLC-puhdistus perustuu hydrofobisuuteen. Se käyttää ei-polaarista stationäärifaasia ja vesiliukoisia puskureita ja orgaanisia liuottimia liikkuvana faasina eluoimaan analyyttejä; polaariset yhdisteet eluoidaan ensin, kun taas ei-polaariset yhdisteet säilyvät. Tämä on paras menetelmä hydrofobisella ryhmällä muunnettujen oligonukleotidien, kuten biotiinin, fluoresoivien väriaineiden etikettien tai NHS-esterikonjugaatioiden puhdistamiseen. Massan talteenotto on suurempi kuin PAGE-puhdistusta käytettäessä, ja se soveltuu suurempien oligonukleotidien puhdistamiseen (mmoli-asteikko), vaikka se ei poista epätäydellisiä tuotteita niin tehokkaasti. Oligonukleotidien puhdistuspatruunat, jotka perustuvat käänteisfaasikromatografiaan, tarjoavat nopean menetelmän oligonukleotidien poistoon ja puhdistamiseen.
Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) erottaa oligonukleotidit niiden pituuden mukaan ja tarjoaa siten riittävän erotuskyvyn erottaakseen täyspitkät tuotteet epäonnistuneista molekyyleistä (Atkinson and Smith, 1984). Polyakryyliamidigeelit ovat tehokkaampia pienten DNA-fragmenttien erottamisessa kuin agaroosigeelit (katso RNA: n analyysi analyyttisellä polyakryyliamidigeelielektroforeesillä ja Agaroosigeelielektroforeesillä). Polyakryyliamidigeelien ainoa haitta on se, että niitä on vaikeampi valmistaa ja käsitellä kuin agaroosigeelejä. Polyakryyliamidigeelit suoritetaan pystysuorassa konfiguraatiossa jatkuvassa sähkökentässä. Elektroforeesin jälkeen oligonukleotidi eluoidaan geelistä ja konsentroidaan etanolin saostuksella (Etsi lisää nukleiinihappojen saostamisesta RNA: n puhdistus – saostusmenetelmillä) tai käänteisfaasikromatografialla. Tämä on valintatapa, kun halutaan suurin osuus täyspitkiä oligonukleotideja vaativiin sovelluksiin. On myös erittäin suositeltavaa oligonukleotideille, jotka ovat pitempiä kuin 30 emästä. Myös useita näytteitä voidaan suorittaa samanaikaisesti eikä kalliita laitteita tarvita. Tämän tekniikan ainoa haittapuoli on pieni määrä oligonukleotidia, joka on saatu puhdistusta kohden. Tyypillisesti oligonukleotideja käytetään asteikolla 1 µmol tai vähemmän, ja massan talteenotto SIVUPUHDISTUKSEN jälkeen on < 50% ja vielä pienempi modifioitujen oligonukleotidien tapauksessa. Vaikka saanto on alhainen, se on kuitenkin tyydyttävä useimmissa biokemiallisissa sovelluksissa.
oligonukleotidivalmiste Ladataan denaturoivaan polyakryyliamidigeeliin, jonka määrä on vähintään 1 mg kaistaa kohti. Geelin erottelukyky riippuu polyakryyliamidin pitoisuudesta. Lyhyille oligonukleotideille (15-35 emästä) suositellaan 13-15% polyakryyliamidigeelejä; pidemmille oligonukleotideille (35-70 emästä) suositellaan 8-13% polyakryyliamidigeelejä. Geelin prosenttiosuus on sovitettava juoksujärjestelmään. Käytämme yleensä Bio-Rad Mini Protean II-järjestelmää ja suoritamme 15% geelejä puhdistaaksemme oligonukleotideja, joiden pituus on 25 emästä. Tunnistamisen jälkeen oikea bändi UV visualisointi, bändi poistetaan ja uutetaan geelistä.
tässä luvussa kuvataan kahta eri menetelmää oligonukleotidien puhdistamiseksi polyakryyliamidigeeleistä. Yksinkertaisin menetelmä on eluointi diffuusion avulla. Tämä perustuu molekyylien liikkeeseen korkeamman konsentraation alueelta pienempään konsentraatioon. Diffuusion tuloksena on materiaalin asteittainen sekoittuminen. Tämä menetelmä on aikaa vievä, mutta se ei vaadi liikaa työvoimaa tai mitään laitteita. Periaatteessa polyakryyliamidinauha, joka sisältää kiinnostavan oligonukleotidin, pilkotaan pieniksi paloiksi ja peitetään eluutiopuskurilla. Inkubaation jälkeen DNA puhdistetaan supernatantista saostamalla etanolia. Saanto on rajallinen, 20-70 prosenttia, riippuen oligonukleotidin pituudesta. Mitä suurempi määrä eluutiopuskuria käytetään, sitä enemmän geelistä leviää oligonukleotidia.
toinen menetelmä on elektroeluutio dialyysipussiin (McDonell et al., 1977). Oligonukleotidia sisältävä geelikappale poistetaan ja asetetaan dialyysipussiin, jossa on puskuri. Sähkövirran käyttö saa DNA: n siirtymään geelistä dialyysipussin puskuriin. Oligonukleotidi otetaan tästä puskurista talteen ja puhdistetaan. Tällä menetelmällä oligonukleotidi voidaan eristää hyvällä tuotolla, vaikka on aikaa vievää, jos suuri määrä näytteitä puhdistetaan samanaikaisesti, koska se vaatii jokaisen geelinauhan lisäämistä yksittäisiin dialyysipusseihin. Tämä menetelmä toimii hyvin myös suuremmille DNA-fragmenteille ja sitä voidaan jopa käyttää DNA: n erottamiseen agaroosigeeleistä.