IC50-pitoisuuksien arviointi välittömästi syöpäreagenssihoidon jälkeen käyttämällä reaaliaikaista solumonitorointilaitetta

käyttöönotto

aiemmin kehitettiin reaaliaikainen solumonitorointijärjestelmä (RTCA) sitoutuneiden solukulttuurien jatkuvaan seurantaan (1). Tämä label-free andnoninvasiivinen menetelmä perustuu kudosviljelylevyjen muodostamien interdigitoituneiden alueiden välisen sähköisen impedanssin (soluindeksi, CI) mittaamiseen. CI-mittaus antaa kvantitatiivista tietoa kiinnittyneiden solujen biologisesta tilasta. Itse asiassa CI: n merkitys on eloonjäämissellon lukumäärä e-levyn pinnalla. Näitä tietoja ovat solujen lukumäärä,elinkelpoisuus ja morfologia reaaliaikaisena profiilina (2-4). RTCAsystem tunnetaan solujen reaktion varhaisesta havaitsemislaitteesta adynaamisena fenotyyppinä joitakin reagensseja vastaan (5).

edellisessä tutkimuksessamme arvioitiin imatinibin sytotoksisuutta oralsquamous cell carcinomy (OSCC) WST: llä.-8(5– 3-(2- Metoksi-4 – nitrofenyyli)-2-(4-nitrofenyyli) – 2h – tetratsoli – 3-ium) – määritys Endpoint-mittauksena (6) ja sen jälkeen rtca-järjestelmällä (7).Sytotoksisuuden arviointiin käytetään harvoin MTT: n (3–2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ja WST-8-määrityksiä. Tällaisia määrityksiä rajoittavat kuitenkin eri syöpälääkkeiden vaikutusten vaihtelut eri solulinjoissa. Lisäksi in vitro-päätetapahtumatesteillä lasketut IC50-arvot ovat yleensä korkeampia kuin In vivo-efektiiviset pitoisuudet (8,9).

edellisessä tutkimuksessamme RTCA-järjestelmän mittaamat IC50-arvot olivat alhaisemmat kuin WST-8-määrityksellä mitatut arvot, mikä viittaa siihen, että RTCA-järjestelmä voi herkästi arvioida sytotoksisuutta ja imatinibin vaikutusta soladhesioniin. On kuitenkin epäselvää, olisiko muiden syöpälääkkeiden, kuten imatinibin ja syöpälääkkeiden, ric50-arvojen arvioinnista hyötyä RTCAsystem-järjestelmän avulla, koska sytotoksisissa reaktioissa on ajan mittaan eroja molekyylitason kohdelääkkeiden, kuten imatinibin, ja syöpälääkkeiden välillä.

tässä tutkimuksessa meidän on valittava tietyntyyppiset solulinjat, jotta voidaan määrittää solujen reaktioprofiili suhteessa syöpäreagensseihin reaaliaikaisesti RTCA-järjestelmää käyttäen.Noninvasiiviset SQUU-a-solulinja ja invasiiviset SQUU-B-solulinja, jotka perustettiin paikallisista toistuvista kielen syöpäkasvaimista yhdellä potilaalla, valittiin, koska olimme mukana tutkimassa SQUU-B-solulinjan etäpesäkkeitä käyttäen SQUU-a-solulinjaa ja SQUU-Bcell-linjaa (10-12). SAS-solulinja perustettiin kielen okasolusyövästä(13). NA-solulinja perustettiin fibronektiiniä tuottavaksi solulinjaksi (14). Lisäksi on raportoitu, ettäsyöpäreagenssien sytotoksisuutta OSCC: ssä on arvioitu SQUU-a-solulinjassa ja SQUU-B-solulinjassa (15), SAS-solulinjassa (16) ja NA-solulinjassa (17) käyttäen erilaisia tavanomaisia menetelmiä.Siksi valitsimme tässä tutkimuksessa neljä tällaista solulinjaa, joilla on jokainen ominaispiirre, joita käytettiin myös aiemmassa tutkimuksessa solumyrkyllisessä määrityksessä.

tässä tutkimuksessa keskityimme uuteen RTCA-laitteeseen, joka kehitettiin reaaliaikaiseen mittaukseen, ja arvioimme theIC50-arvot asteikkona, jolla arvioitiin syöpälääkkeiden sytotoksisuutta neljää OSCC-solulinjaa kohti. Tämän ansiosta saimme tietoa eri syöpäreagenssien ja solulinjojen välillä havaituistavaihteluista reaaliaikaisesti.

tämän tutkimuksen tavoitteena oli saada 50 profiilia heti syöpälääkkeiden lisäämisen jälkeen RTCA-järjestelmää käyttäen. Tässä tutkimuksessa osoitettiin RTCA-järjestelmää käyttävien syöpälääkkeiden sytotoksisuuden arvioimisen etu päätetapahtumakokeeseen verrattuna.

materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja materiaalit

5-fluorourasiili (5-FU) laimennettiin 100 mM: n indimetyylisulfoksidiksi (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, Yhdysvallat).Doksifluridiini laimennettiin 100 mM: iin ja karboplatiini 50 mM: iin tislatussa vedessä. Dosetakseli laimennettiin 10 mM: n inetanoliksi. Kaikki syöpäreagenssit hankittiin wako Purekemical Industries, Ltd: ltä., (Osaka, Japani) ja varastoidaan -20°C: ssa.

soluviljelmä

ihmisen OSCC-solulinjat SQUU-a, SQUU-B, SAS ja NAwere on saatu ihmisen kielinäytteistä. SQUU – A ja SQUU-B, joita Morifuji-Wilson M (Kumamoto University,Kumamoto, Japani) tarjosi, perustettiin paikallisista toistuvista tonguecancer-kasvaimista (18). SAS (13,19,20) ostettiin Riken BRC Cell Bankista (Tsukuba, Japani). NA (14) oli ystävällisesti toimittanut tohtori Jun-ichi Iwata (Kyushun yliopisto, Fukuoka, Japani). Kaikki solulinjat säilyivät dulbeccon muunnellussa Eagle ’ s Mediumissa (DMEM;Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japani), joka sisältää 10% sikiön vasikan seerumia(Biowest, Nuaille, Ranska) 37°C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO2: lla.

OSCC-solujen proliferaation mittaaminen RTCA-sytotoksisuusmäärityksellä

CI saatiin jäänestojärjestelmällä (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, Yhdysvallat) RTCA-järjestelmänä. Kaikki seuranta suoritettiin 37°C: ssa säännellyllä CO2-pitoisuudella (5%). E-levyt (jäätymisjärjestelmän viljelylevyt), jotka sisältävät 200 µl viljelyainetta kaivoa kohti, tasapainotettiin 37°C: seen, ja CI asetettiin nollaan näissä olosuhteissa. Soluihin (2×104 solua/kuoppa, ellei toisin mainita) lisättiin 560 µl viljeltyä kasvualustaa syöpälääkkeitä 24 tunnin kuluttua solujen jakamisesta. Luottamusväliä seurattiin reaaliajassa 96 tunnin kuluttua solujen kylvöstä. IC50-arvot on laskettu RTCAData Analysis Software version 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).

kahdeksan pisteen pitoisuudet neljälle syöpälääkkeelle asetettiin Cmax-arvojen perusteella edellisessä tutkimuksessa(21-25). Lisäksi aikapisteet asetettiin 72 tunnin aikana, mukaan lukien 24 ja 48 tuntia, jotka olivat yleinen menetelmä sytotoksisuuden arvioimiseksi end-point-määrityksessä.

Ic50datan käyrän sovitus

käytimme seuraavia sigmoidisia annos-vastemuotoja IC50-arvojen laskemiseen: Y=Low CI + (HighCI-Low CI) / {1+10 ^ (Log IC50-X)}, jossa ”Low CI” edustaa CI: n vähimmäisarvoja, ”High CI” edustaa CI: n enimmäisarvoja, Y on solun indeksi ja X on konsentraation log (M).

OSCC-solujen proliferaation mittaaminen WST-8-menetelmällä

OSKC-solujen ensimmäisen kylvön ja viljelyn jälkeen viljelyaine poistettiin ja korvattiin syöpälääkettä sisältävällä viljelyaineella. Jälkeen 24, 48, ja 72 h inkubaatio, 20µl WST-8 väriaine (Cell Counting Kit-8; Dojindo Corporation,Tokio, Japani) lisättiin jokaiseen hyvin. 3 tunnin kuluttua levyjen lukemaksi tuli 450 nm / 655 nm. Solujen elossaololuku laskettiin käyttäen alla olevaa kaavaa (7). IC50-arvot laskettiin lineaarisella approksimaatioregressiolla prosentuaalisesta eloonjäämisestä verrattuna lääkeainepitoisuuteen.

solujen eloonjäämisaste (%)=(a-c) / (b-c) ×100(a=absorbanssi syöpäreagenssin kullakin pitoisuudella,B=absorbanssi syöpäreagentin 0 µM: n pitoisuudella ja C=nollan absorbanssi).

tilastollinen analyysi

kaikki tiedot esitetään kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ± keskihajonta(SD). RTCA-järjestelmän ja WST-8-määrityksen avulla saatujen arvojen väliset korrelaatiot arvioitiin tilastollisesti Merkitseviksi Spearmantestilla. Kaksihäntäisiä arvoja p<0, 05 pidettiin merkittävinä.

tulokset

syöpälääkityksen vaikutus OSCC-solujen proliferaatioon RTCA-järjestelmän avulla

arvioimme neljän syöpälääkkeen (5-FU, doksifluridiini, karboplatiini ja dosetakseli) sytotoksisuutta fourOSCC-solulinjoissa seuraamalla CI-arvoja 96 tunnin ajan sen jälkeen, kun solut oli kylvetty 2×104 soluun / kuoppa e-levyissä(viikunat. 1–4). CI-arvot pienenivät adoosista riippuvaisesti kaikissa neljässä OSCC-solulinjassa. Näin ollen CI-arvojen pieneneminen korreloi solun pienenemisen kanssa number.As esitetty kuvassa. 2, invasive SQUU-B-solulinjan CI-arvo oli pienempi kuin muilla OSCC: llä cells.As esitetty kuvassa. 3, CI profileobained SAS-solulinjaan osoitti viivästynyttä kasvua 48 tunnin jälkeen. 4, proliferaationopeus ja Max CI-arvo NA-solulinjassa olivat suuremmat kuin yksi muista solulinjoista.

reaaliaikainen syöpälääkkeiden ric50-profiilien mittaus OSCC-soluissa käyttäen RTCA-järjestelmää

neljän OSCC-solulinjan neljän syöpälääkkeen IC50-profiilit määritettiin Rtcasystemillä ja laskettiin instrumentin mukana toimitetulla kaupallisella ohjelmistolla (SQUU-b-tietojen osajoukko on esitetty kuvassa. 5). IC50-arvot merkittiin 72 tuntiin syöpälääkkeiden lisäämisen jälkeen. Kaikkien nelisolulinjojen 24, 48 ja 72 h: n arvot on koottu taulukoihin I–IV, kuten kuvassa esitetään. 5, 5-FU: n sytotoksisissa reaktioissa oli viive (kuva. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. WST-8-määritystä käyttävän squu-B: n solujen elinkykykäyriä esitettiin myös täydentävissä materiaaleissa(Figs. S5-S8). R2-arvot 72 tunnin kohdalla WST-8-testin syöpälääkereagenssien jälkeen olivat alhaiset neljällä syöpälääkereagenssilla verrattuna yhteen 24 tunnin ja 48 tunnin reaktioista. nämä tulokset osoittivat, että on toivottavaa, että end-point-määritys suoritetaan 24 tunnin tai 48 tunnin kuluttua, jotta sitä voidaan käyttää yleisenä protokollana. Tässä tutkimuksessa WST-8-määrityksen solujen elinkykykäyrät osoitettiin toimittamattomista materiaaleista, koska IC50-arvojen laskennassa WST-8-määritystä käyttäen ei ollut mitään uutta.

korrelaatiot IC50-arvojen reaaliajan mittausten välillä RTCA-järjestelmää käyttäen ja IC50-arvojen Endpoint-mittausten välillä käyttäen WST-8-määritystä OSCC-soluissa

kuten kuvassa. 6, IC50-arvot 24, 48 ja 72 h: ssa kahdella menetelmällä merkittiin. Vaaka-akseli näyttää reaaliaikaiset IC50-arvot, jotka on mitattu RTCA-järjestelmällä, kun taas pituusakseli näyttää Endpoint IC50-arvot, jotka on mitattu WST-8-määrityksellä. Näiden kahden testimenetelmätyypin välillä havaittiin apositiivista korrelaatiota IC50: n mittaamiseksi kullekin syöpälääkkeelle.Tulokset 5-FU: sta, doksifluridiinista, karboplatiinista ja doketakselwerestä y=8, 19 x+346,02 (R2=0, 94, rs=0, 66, *p<0,05), y=1, 00 x+172, 70(R2=0,91, rs=0, 82, **p<0, 01), y=1, 90 x+206, 81 (R2=0, 92, RS=0, 96, **p<0, 01), Andy=13, 53 x+0, 08 (R2=0, 95, RS=0, 73, *p<0, 05) vastaavasti. Real-timeIC50-arvot olivat yleensä pienempiä kuin vastaavatendpoint IC50-arvot.

Keskustelu

RTCA: n laskemat CI-arvot kuvaavat myös solun tilaa (3). Idiootti viikunoissa. 1-5, CI-arvojen SD-arvot olivat liian pieniä toseeta. Esimerkiksi kaikki SD arvot Fig.1 oli alle 0,05. Syy squu-B: n alhaisiin CI-arvoihin osoitettiin, että adheesioproteiini E-cadherinilla on essentialrooli metastaasissa, jossa e-cadherinin promotingcell migration-ja cell invasion-tasot (26) ovat vähentyneet. Syyksi ofNA: n korkeisiin Max CI-arvoihin on esitetty, että on raportoitu fibronektiinisolujen proliferaatiota ja adheesiota, joka johtuu ofNA-solulinjan ominaisuudesta fibronektiiniä tuottavana solulinjana (6). Siten kunkin solulinjan solureaktiot neljää syöpäreagenssia vastaan olivat vaihtelevia. Emme löytäneet IC50-arvojen ja solulinjojen luonteen välistä syy-yhteyttä tässä tutkimuksessa. On kuitenkin tärkeää tarkastella solureaktiota reaaliaikaisesti CI-profiilina, jotta voidaan arvioida syöpäreagenssin myrkyllisyyttä, kun harkitaan lääkevalmisteen käyttöä ihmiseen.

SQUU-B-solulinjan IC50-profiili kuvailtiin Kuvassa. 5 koska ovat presentatiivinen IC50 profiili, koska ei ollut eroja IC50 Profiilin kuvio samassa solulinjassa samalla reagenssilla, vaikka laskimme IC50 arvot kaikissa solulinjassa käyttäen neljää syöpäreagenssia. Huomasimme, että theIC50-profiilit vaihtelivat kunkin syöpälääkkeen ja kunkin OSCC-solulinjan osalta. Kuten kuvassa.5,5-FU ja dosetakseli tarvitsivat yli 24 tuntia (48 tuntia kuvassa) sytotoksisen vaikutuksen aloittamiseen OSCC-soluissa, kun taas IC50-arvot olivat palautuneet noin 24 tunnista(48 tuntia kuvassa) doksifluridiinin ja karboplatiinin lisäämisen jälkeen. Näin ollen ehdotimme, että erot reaaliaikaistenic50-profiilien johtui syöpäreagenssista. Tällaiset huomiot eivät olisi olleet mahdollisia ilman reaaliaikaista mittausta RTCA: n avulla. Reaaliaikainen seuranta theIC50 arvot myös paljasti, että nämä arvot muuttuivatmerkittävästi ajan myötä. On mahdollista, ettämuutoksia ei havaita tavanomaisilla menetelmillä, koska SYÖPÄLÄÄKKEENKÄSITTELYN jälkeen vain yksi IC50-aikapiste arvioidaan päätetapahtumamäärityksellä.

RTCA-järjestelmä poikkeaa perinteisistä Endpoint-määrityksistä, koska impedanssin mittaus on ei-invasiivista ja se voi tarjota korkealaatuisia, kvantitatiivisia tietoja sytotoksisuudesta jatkuvalla tavalla. Kuten kuvassa.6, RTCA-järjestelmällä saatujen C50-arvojen ja WST-8-määrityksen välillä oli merkittäviä positiivisia korrelaatioita, vaikka CI: n absoluuttisissa arvoissa oli joitakin eroja, kuten SQUU-B-solulinjasta saadut alhaiset CI-arvot. Tulokset viittasivat siihen, että jopa joidenkin solulinjojen Alhainen luottamusväli pystyisi arvioimaan sytotoksisuuden suurta herkkyyttä Rtcasystemissä. Vaikka reaaliaikaiset IC50-arvot olivat pienempiä kuin Endpoint IC50-arvot, kun RTCA-järjestelmällä saatuja reaaliaikaisia IC50-arvoja verrattiin WST-8-määrityksellä saatuihin theendpoint IC50-arvoihin.Nämä tulokset viittaavat siihen, että RTCA-järjestelmää voidaan käyttää syöpälääkkeiden vaikutusta solujen proliferaatioon ja adheesioon herkästi arvioitaessa.

RTCA-järjestelmässä kiinnittynyt solu toimii eristeenä elektrodin pinnalla ja muuttaa elektrodiliuoksen ionista väliainetta, mikä lisää impedanssia (27). CI on siis solujen määrän ja suhteen funktio eri aikavälein. CI=0, kun solujen tarttuvuutta ei ole (5). Rtca-järjestelmän kuvaamat sichanges ovat solun dynaamisia fenotyyppejä. Solujen ja lääkkeiden yhteisvaikutusten dynaamisen seurannan avulla voidaan saada parempi käsitys invitro-aikavaikutuksista, erityisesti heti lääkehoidon jälkeen (28). Kineettinen ominaisuus thecells tarjoaa oivaltavaa tietoa, jota ei voida hankkia akonventionaalisesta yhden päätepisteen määrityksestä, kuten WST-8-määrityksestä. Vaikka WST-8-määrityksen tulokset heijastuvat survivalcellin metaboliseen reaktioon (29). WST-8-määritystä käytettäessä toksisuus voidaan aliarvioida, jos solujen metaboliareaktio tapahtui, vaikka tapahtui dynaaminen solureaktio. Olemme ehdottaneet, että nämä erot principal kahdessa menetelmässä indusoitiin ahuge eroja IC50 arvo jopa 8 kertaa twometods kuten kuvassa. 6a. edellinen tutkimuksemme kertoi, että imatinibin IC50-arvo SQUU-Acelleissa RTCA-järjestelmällä laskettuna oli 4 µM ja WST-8-määrityksellä laskettuna 60µm (herkkyys 15 kertaa) (6,7). Muut tutkimusryhmät raportoivat, että sisplatiinin IC50-arvo HK-2selluissa RTCA-järjestelmällä laskettuna oli 0, 76 µM ja WST-8-määrityksellä laskettuna 25µm (herkkyys 33-kertainen) (30, 31).Nämä aiemmat tiedot tukivat tietojamme oikeellisuuden osoittamiseksi.

on tärkeää ottaa heti syöpälääkityksen jälkeen mittaukset, jotta voidaan arvioida sekä lääkeaineiden haittavaikutukset että niiden toivotut vaikutukset. Invitro-tietoja ja ihmisen in vivo-tietoja vastaavista hyödyllisistä menetelmistä on kuitenkin raportoitu vain vähän. Katsoimme, että reaaliaikainen mittaus RTCA-järjestelmällä hyödyttäisi syöpälääkkeiden haittavaikutusten arviointia normaaleissa soluissa.

aiemmin ilmoitetut 5-FU: n,doksifluridiinin, karboplatiinin ja dosetakselin Cmax-arvot ovat 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), 2 µM (24,25),kun sitä käytetään laskimonsisäiseen hoitoon ihmisillä. Tietomme korreloivat ihmisillä saatujen tietojen kanssa, koska Cmax-arvot sisältyivät tässä tutkimuksessa käytettyjen kokeellisten annosten vaihteluväliin.

RTCA-järjestelmät ovat uusi pääasiallinen laite sytotoksisuuden arvioimiseksi, sillä niissä käytetään soladhesionin impedanssin intensiteettiä eikä entsyymiaktiivisuutta kohdesoluissa, kuten MTT-määrityksessä. RTCA-järjestelmällä lasketut syöpälääkkeiden IC50-arvot korreloivat merkitsevästi tavanomaisella päätetapahtumamäärityksellä laskettujen IC50-tasojen kanssa. Lisäksi RTCA-järjestelmä sai mittaukset automaattisesti reaaliaikaisesti heti syöpälääkityksen jälkeen.

itse asiassa RTCA-järjestelmä ei pysty arvioimaan suoranaista sytotoksisuutta, kuten solukuolemaa tai apoptoosia ja niin edelleen,koska solu-indeksi laskettiin impedanssin perusteella. Siksi RTCA-järjestelmän ja solukuoleman mittausyhdistelmä voi olla tehokas menetelmä, jos konkreettinen solureaktio, kuten solukuolema tai apoptoosi, arvioidaan tarkasti.Esimerkiksi Annexin V-värjäys tai kaspaasi-3-määritys apoptoosin toteamiseksi, laktaattidehydrogenaasin (LDH) release määritys solukuoleman toteamiseksi voivat olla tehokkaita menetelmiä(32,33). Lisäksi voi olla hyödyllistä arvioida tulehdusproteiinin ilmentymistä tavallisissa soluissa sivuvaikutusten havaitsemiseksi, kun syöpälääkereagenssia lisättiin e-levylle kylvettyihin tavallisiin soluihin. Dynaaminen reaaliaikainen seuranta soluviljelyn aikana, mukaan lukien syöpäreagenssit, voi tarjota arvovalaisimia terapeuttisen tehokkuuden ja sivuvaikutuksen varhaiseen havaitsemiseen, jota ei voida arvioida tavanomaisilla menetelmillä loppupistemäärityksessä. RTCA-järjestelmällä laskettu IC50-arvo voi siis olla hyödyllinen parametri esimerkiksi reaaliaikaisen mittauksen seulontaan automaattisessa seulonnassa, kolorimetristen ongelmien välttämiseen tai kontaminaatioon. Lisäksi RTCA-järjestelmä mahdollistaa kokeen koko jakson analysoinnin eikä vaadi merkintää, joka voi vaikuttaa negatiivisesti solukulttuurin kokeisiin.

tämän tutkimuksen uutuus on se, että RTCA-järjestelmä pystyisi havaitsemaan sytotoksisuuden suuren herkkyyden verrattuna tavanomaiseen metodiin, WST-8-määritykseen. Lisäksi RTCA-järjestelmä voisi arvioida 50: n arvon ennustettavasti reaaliaikaisesti ilman rajoitusta koejaksolle vähintään 72 tunnin ajan syöpäreagenssien lisäämisen jälkeen.

johtopäätöksenä tuloksemme osoittivat, että Rtkasysteemit ovat hyödyllisiä sytotoksisuuden määrityksessä ja että niitä voitaisiin käyttää solunsalpaajien kehittymisessä syöpäsoluilla ja niiden sivuvaikutusten arvioinnissa normaaleissa soluissa. Lisäksi RTCA-järjestelmää voidaan käyttää syövän reagenssien solujen reaktioprofiilien,kuten yhdistelmähoidon ja vasta-aine-solu-tai lääkeaineinteraktioiden, arviointiin.

lisäaineisto

tukitiedot

vahvistukset

ei sovelleta.

rahoitusta

rahoitusta ei saatu.

tietojen ja aineistojen saatavuus

tässä tutkimuksessa käytetyt ja / tai analysoidut aineistot ovat saatavissa vastaavalta tekijältä reasonablequest-pyynnöstä.

tekijöiden osuudet

mh ja mn ideoivat ja suunnittelivat tutkimuksen. MH andTN suoritti kokeet ja hankki tiedot. MH analysoi tiedot, laati luvut ja laati käsikirjoituksen. MH, TKY ja mn tulkitsivat tulokset. MH ja TKY muokkasivat ja tarkensivat sanakirjaa. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet ja hyväksyneet finalmanuskirjoituksen.

eettinen hyväksyntä ja suostumus