| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein strukturer: | Pfam | PDB | pdbsum | |||
tak pola har en samlet struktur svarende til E. coli Pola. Det midterste 3′ -5 ‘ eksonukleasedomæne, der er ansvarlig for korrekturlæsning, er blevet ændret dramatisk og er ikke funktionelt. Det har et funktionelt 5’ -3 ‘ eksonukleasedomæne ved amino-terminalen, beskrevet nedenfor. De resterende to domæner fungerer i koordination via koblet domænebevægelse.
Eksonuklease domineretdet
Tak polymeraseeksonuklease er et domæne, der findes i amino-terminalen af Tak DNA-polymerase i (termostabil). Det antager et ribonuklease H-lignende motiv. Domænet giver polymerasen 5′ -3 ‘ eksonukleaseaktivitet.
I modsætning til det samme domæne i E. coli, som ville nedbryde primere og skal fjernes ved fordøjelse til PCR-brug, siges dette domæne ikke at nedbryde primeren. Denne aktivitet bruges i Takman-sonden: når datterstrengene dannes, kommer proberne, der er komplementære til skabelonen, i kontakt med polymerasen og spaltes i fluorescerende stykker.
Binding med DNAEdit
tak polymerase bindes ved dets aktive polymerasespalte med den stumpe ende af dupleks-DNA. Da polymerasen er i kontakt med det bundne DNA, danner dens sidekæder hydrogenbindinger med DNA ‘ ets puriner og pyrimidiner. Den samme region af Tak polymerase, der er bundet til DNA, binder også med eksonuklease. Disse strukturer bundet til tak-polymerasen har forskellige interaktioner.
Mutanterredit
et stedstyret mutageneseeksperiment, der forbedrer den vestigale 3′-5′ eksonukleaseaktivitet med en faktor 2, er rapporteret, men det blev aldrig rapporteret, om dette reducerer fejlfrekvensen. Efter en lignende tankegang er kimærproteiner fremstillet af kirsebærplukkende domæner fra E. coli, tak og T. neapolitana polymerase I. bytte ud det vestigale domæne til et funktionelt fra E. coli skabte et protein med korrekturlæsningsevne, men en lavere optimal temperatur og lav termostabilitet.
versioner af polymerasen uden 5′ -3 ‘ eksonukleasedomænet er produceret, blandt hvilke Klentak eller Stoffragmentet er bedst kendt. Den fuldstændige mangel på eksonukleaseaktivitet gør disse varianter egnede til primere, der udviser sekundær struktur såvel som til kopiering af cirkulære molekyler. Andre variationer inkluderer anvendelse af Klentak med en high-fidelity-polymerase, en Termosækvenase, der genkender substrater som T7 DNA-polymerase gør, mutanter med højere tolerancer over for hæmmere eller “domænemærkede” versioner, der har et ekstra spiralhår-spiralmotiv omkring det katalytiske sted for at holde DNA ‘ et tættere på trods af ugunstige forhold.
betydning i sygdomsdetekteringredit
på grund af forbedringerne Tak polymerase tilvejebragt i PCR DNA replikation: højere specificitet, færre uspecifikke produkter, og enklere processer og udstyr, det har været medvirkende til bestræbelserne på at opdage sygdomme. “Anvendelsen af polymerasekædereaktion (PCR) til diagnose af infektionssygdomme har resulteret i en evne til at diagnosticere tidligt og behandle passende sygdomme på grund af hurtige patogener, bestemme den antimikrobielle modtagelighed af langsomt voksende organismer og fastslå infektionens kvante.”Implementeringen af tak polymerase har reddet utallige liv. Det har tjent en væsentlig rolle i påvisning af mange af verdens værste sygdomme, herunder: tuberkulose, streptokokfaryngitis, atypisk lungebetændelse, AIDS, mæslinger, hepatitis og ulcerative urogenitale infektioner. PCR, den metode, der bruges til at genskabe kopier af specifikke DNA-prøver, muliggør sygdomsdetektion ved at målrette mod en specifik DNA-sekvens af et målrettet patogen fra en patients prøve og forstærke spormængder af de vejledende sekvenser ved at kopiere dem op til milliarder gange. Selv om dette er den mest nøjagtige metode til sygdomsdetektion, især for HIV, udføres den ikke så ofte som alternative, ringere tests på grund af de relativt høje omkostninger, arbejdskraft og tid, der kræves.
afhængigheden af tak polymerase som katalysator for PCR-replikationsprocessen er blevet fremhævet under COVID-19-pandemien i 2020. Mangel på det nødvendige f.eks. har forringet evnen hos lande over hele verden til at producere testkits til virussen. Uden tak polymerase er sygdomsdetekteringsprocessen meget langsommere og kedelig.
på trods af fordelene ved at bruge Tak-polymerase i PCR-sygdomsdetektering er ikke uden sine mangler. Retrovirale sygdomme: HIV, HTLV-1 og HTLV-II; inkluderer ofte mutationer fra guanin til adenin i deres genom. Mutationer som disse er det, der tillader PCR-test at påvise sygdommene, men tak polymerases relativt lave troskabshastighed får den samme g-til-a-mutation til at forekomme og muligvis give et falsk positivt testresultat.