for at udnytte kraften i målrettede homingendonukleaser arbejdede Jerome lab for at optimere et nyttigt leveringssystem til både in vivo og in vitro undersøgelser. De brugte et adeno-associeret virus (AAV) leveringssystem til at målrette musens trigeminale ganglier med en af to HSV-specifikke endonukleaser: HSV1m5, som er designet til at spalte virionproteinet VP5-genet, og HS1m8 ,der er målrettet mod genet, der koder for DNA-polymerase-katalytisk underenhed. Oprettelse af mutationer i et af disse gener forårsager forstyrrelse af det virale genom og forhindrer virionproduktion. For yderligere at øge virkningerne af Behandlingstreks-2 blev en 3′-5′ endonuklease, som har vist sig at øge rettet mutagenese, Co-transduceret. Efter etableringen af systemet startede laboratoriet in vitro-arbejde med fokus på neuroner, den biologisk relevante celletype. Kulturer af neuroner blev co-transduceret med HSV1m5 eller 8 og Trek-2 og derefter inficeret med HSV. Behandlede kulturer viste en 50% reduktion i viral titer såvel som tilstedeværelsen af mutationer i HSV ved T7 endonuklease 1-analysen og klonal sekventering. Når forstyrrelse af lytisk infektion blev etableret, begyndte forskerne at se på effekter på de forskellige stadier af HSV-infektion. Ved hjælp af inficerede kulturer af neuroner med HSV og efterfølgende behandlet med HSV1m5 eller 8 med Trek-2 på forskellige tidspunkter kunne forskerne simulere de forskellige infektionsstadier. De behandlede kulturer efter 7 dage (akut fase), 14 dage (sen akut/ tidlig latent fase) og 32 dage (latent fase) og fandt ingen ændring i virkning uanset viral fase. Dette antyder, at HSV er ligeledes modtagelig for endonukleasemutagenese uanset viral fase. Niveauerne af mutationer på målstedet varierede fra henholdsvis 4,5-7,6% og 1,1-6,6% for HSV1m5 og hsv1m8. I øjeblikket er dette den første undersøgelse, der ser på endonukleaseaktivitet i latent inficerede neuroner.opmuntret af in vitro-resultaterne udførte forskerne in vivo-undersøgelser ved hjælp af mus inficeret med HSV efterfulgt 32 dage senere af AAV (udtrykker hsv1m5 eller 8 og Trek-2) injektion. Neuroner fra musene blev udtaget 30 dage efter AAV-injektion for viral titer, viral belastning og HSV-genommutationer. Gruppen viste 1-2% mutationer hos 2/4 mus for HSV1m5 og hos 3/4 mus for HSV1m8. Imidlertid var virusbelastningen af disse dyr ens mellem kontrol-og behandlede dyr. Virusudskillelse blev forsinket med en dag hos behandlede dyr, men nåede lignende niveauer over tid sammenlignet med ubehandlet. Efter at have reflekteret over resultaterne sagde Dr. Jerome, “dette er første gang, at der er etableret en faktisk latent virusinfektion hos et dyr og derefter deaktiveret, endda delvist, ved hjælp af endonukleasebehandling. Så det repræsenterer et kritisk skridt i retning af at bringe sådanne terapier til menneskelig anvendelse. Den største udfordring nu er at øge styrken af terapien, så hele eller næsten hele den latente virus er genetisk deaktiveret. Vi undersøger nyere, mere effektive nukleaser som CRISPR / Cas og evaluerer nye metoder til at levere nukleaser til inficerede neuroner in vivo.”I fremtiden kan denne terapi føre til en ny måde at tænke på at behandle latente sygdomme som HSV og HIV, som vi i øjeblikket betragter som uhelbredelige.
finansiering til denne forskning blev leveret af National Institutes of Health og Canadian Foundation.L, Stensland L, Huang ML,Greninger al, Roychoudhury P,Niyonsima N,Nguyen T, Magaret a, Galleto R, sten D, Jerome KR. 2016. In vivo forstyrrelse af latent HSV ved designer endonuklease terapi. JCI indsigt, 1 (14).